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UPLC-MS / MS 测定复方丹参方中丹参酮ⅡA 、 丹参酚酸 B、人参皂苷 Rg1 及其在大鼠血浆和脑组织

2020-03-11 14:45 出处:未知 人气: 评论(0
  摘要]建立大鼠血浆和脑组织中丹参酮ⅡA(TSⅡA)、丹酚酸B(SAB)、人参皂苷Rg1(GRg1)的UPLC-MS/MS分析方法,并开展药物动力学研究。选用SD大鼠,单剂量灌胃(ig)复方丹参方,采集血液与脑组织样品,采用UPLC-MS/MS测定血浆和脑组织中TSⅡA、SAB和GRg1的浓度,以PhoenixWinNolin6.1药动学程序软件对数据进行非房室模型拟合,采用统计矩法计算药动学参数。经方法学考证,3种成分的峰面积与其在血样及脑组织中的浓度线性关系良好(r>0.9922);回收率为58.86%~112.1%,日内、日间RSD≤9.7%,准确度及稳定性均符合体内药物分析的要求。大鼠ig给复方丹参方后的血浆药动参数如下:丹参酮ⅡT(1.58±0.081)h,C(725.4±88.20)μg·L-1,AUC(2101.3±124.85)μg·h·L-1,MRT
 
  (3.66±0.05)h;丹酚酸BT(1.29±0.21)h,C(307.9±46.75)μg·L-1,AUC(537.4±88.24)μg·h·L-1,MRT
 
  (2.08±0.11)h;人参皂苷RgT (1.42±0.20)h,C (460.38±154.60)μg·L-1,AUC(383.4±88.16)μg·h·L-1,
 
  MRT(1.87±0.046)h。脑组织药动参数如下:丹参酮ⅡT(0.75±0.22)h,C(1.41±0.420)ng·g-1,AUC(4.34±
 
  2.48)ng·h·g-1,MRT(4.00±1.90)h;丹酚酸BT (1.08±0.20)h,C (21.09±4.850)ng·g-1,AUC(14.83±
 
  3.160)ng·h·g-1,MRT(0.99±0.08)h;人参皂苷RgT (0.50±0.16)h,C (130.96±54.220)ng·g-1,AUC
 
  (136.24±34.350)ng·h·g-1,MRT(2.87±0.33)h。该研究所建立的UPLC-MS/MS方法可用于大鼠血浆及脑组织中丹参酮ⅡA、丹酚酸B、人参皂苷Rg1中的药动学研究。
 
  [关键词]UPLC-MS/MS;丹参酮ⅡA;丹酚酸B;人参皂苷Rg1;药动学
 
  复方丹参方由丹参、三七和冰片3味中药组成,活血化瘀,理气止痛,被广泛用于冠心病、心复绞痛、脑缺血再灌注损伤、脑缺血、阿尔兹海默病等[1-3],疗效确切,《中国药典》1977年版至2015年版均有收载,且已列入国家基本药品目录。研究表明,丹参主要有效成分为丹参酮ⅡA、隐丹参酮等脂溶性丹参酮类和丹参酚酸B、丹参素等水溶性丹参酚酸类,对心肌缺血、脑缺血以及脑缺血再灌注损伤具有明显的保护作用[4]。三七皂苷R、人参皂苷Rg和Rb等三七皂苷类是三七的主要有效成分,具有改善微循环、抗血栓形成和扩张血管等作用[5]。冰片为佐使药,芳香走窜,“引药上行”。
 
  近年来,有关复方丹参方药理药效、药代动力学、剂型、质量控制等研究报道较多。在药代动力学领域,大多局限于丹参、三七单独或联合给药后大鼠血浆药动学行为研究,或注射单体后于某一时间点在大鼠脑组织中的分布情况研究[6-9]。本研究采用UPLC-MS/MS技术,建立了复方丹参方中主要有效成分丹参酮ⅡA、丹参酚酸B、人参皂苷Rg1在大鼠血浆和脑组织中定量分析方法,并应用此分析方法对大鼠血浆及脑组织中的药动学特征进行了研究,为进一步开展复方丹参方配伍规律、临床应用研究奠定基础。
 
  1材料
 
  WatersXevoTQ-S型三重四极杆液质联用仪,包括WatersAcquityI型UPLC液相色谱仪带自动进样器和柱温箱,带电喷雾离子化源(ESI)和Mass-LynxV4.1软件数据处理系统(Waters,美国);MET-TLERTOLEDOMS105DU型1/10万天平(MET-TLER,美国);VORTEX-6旋涡混合器(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司);VIBRAXVXR振荡器(德国IKA公司);EppendorfCentrifuge5415型冷冻高速离心机(德国);吉尔森移液器;ND100-1氮气吹扫仪(杭州瑞诚仪器有限公司)。
 
  丹参酮ⅡA(TSⅡA,纯度99.08%,批号Must-15081916)、丹酚酸B(SAB,纯度99.08%,批号Must-15092512)、人参皂苷Rg1(GRg1,纯度98.10%,批号Must-15042215)对照品购自成都曼斯特生物科技有限公司;多潘立酮对照品(批号100304-201103)和双氯酚酸钠对照品(批号100334-200302)购自中国食品药品检定研究院;三七总皂苷(批号Must-15060601,人参皂苷Rg1的质量分数为44.8%);冰片(湖南科瑞鸿泰股份有限公司)和丹参(湖南崇善堂中药饮片有限公司)经中南大学药学院李劲平副教授鉴定均符合药典规定;丹参煎液的制备:取丹参饮片300g,按2015年版《中国药典》中复方丹参片中丹参的提取工艺进行提取,并浓缩至200mL。用HPLC测定丹参煎液中TSⅡA6g·L-1,SAB30g·L-1。甲醇、乙腈(色谱纯,Mer-ck);甲酸(色谱纯,ACS);水(娃哈哈纯净水);其他为分析纯试剂。
 
  SPF级SD雄性大鼠66只,体重(220±20)g,由中南大学湘雅三医院动物实验中心提供,合格证号SCXK(湘)2014-0016。
 
  2方法
 
  2.1 给药与样品采集
 
  大鼠适应性喂养1周后,实验前12h禁食不禁水,并随机分为11组,每组6只,各组大鼠均按丹参15g·kg-1(TSⅡ60mg·kg-1,SAB300mg·kg-1),三七5g·kg-1(GRg150mg·kg-1),冰片300mg·kg-1ig给药。于给药前和给药后15,30,45min和1,1.5,2,4,6,8,10h摘除眼球采血,肝素抗凝。并立即在冰台上快速取大鼠脑组织,剥离软脑膜,生理盐水洗净,滤纸吸干表面水分,称重,以生理盐水为匀浆液,按1mL生理盐水含0.45g脑组织进行匀浆,将血浆以及脑组织匀浆样品均放置于-20℃冰箱保存。
 
  2.2 样品处理
 
  2.2.1 血浆中TSⅡA,GRg1测定样品处理 精密吸取100μL血浆,精密加入15μL多潘立酮(20μg·L-1)混匀,加入300μL乙腈,于震荡器上震荡10min(1500r·min-1),13200r·min-1离心8min,吸取上清液100μL置于新EP管中,加入200μL水,涡旋混匀,取10μL进样检测。
 
  2.2.2脑组织TSⅡA,GRg1测定样品处理精密吸取100μL脑组织匀浆,精密加入5μL多潘立酮溶液(20μg·L-1)混匀,加入150μL乙腈,于震荡器上震荡10min(1500r·min-1),13200r·min-1离心8min,吸取上清液100μL置于新EP管中,加入150μL水,涡旋混匀,取10μL进样检测。
 
  2.2.3血浆及脑组织中SAB测定样品处理精密吸取200μL血浆或脑组织匀浆,精密加入10μL双氯芬酸钠溶液(1mg·L-1)混匀,加入80μLHCl溶液(1mol·mL-1)混匀,再以2mL乙酸乙酯震荡(1500r·min-1)提取10min,吸取上清,于40℃下N2吹干,150μL50%乙腈溶液复溶,13200r·min-1离心8min,取上清10μL进样检测。
 
  2.3测定条件
 
  2.3.1色谱条件分别建立测定血浆与脑组织样品中TSⅡA,GRg1,SAB浓度的色谱条件。色谱柱ACQUITYUPLCTMBEH苯基柱(2.1mm×50mm,
 
  1.7μm),流动相A为乙腈(含0.1%甲酸),B为0.25%甲酸水,柱温为35℃,进样体积10μL。TSⅡA,GRg1和内标多潘立酮的梯度洗脱程序为0~3min,24%A,3~4min,24%~85%A,4~6min,85%A,6~7min,24%A,流速0.2mL·min-1。SAB和内标双氯芬酸钠梯度洗脱程序为0~1.8min,35%A,1.8~4min,35%~60%A,4~5min,60%~35%A,流速为0.25mL·min-1。
 
  2.3.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI),分别以正、负离子模式检测。正离子模式检测TSⅡA,GRg1和多潘立酮,负离子模式检测SAB和双氯芬酸钠。工作参数设置为:离子源温度500℃,喷雾电压3.0kV,雾化气N的流速为1000L·h-1,碰撞气氩气的流速为0.12mL·min-1。扫描方式为多反应检测(MRM),检测以下离子反应m/z295/249.3(TSⅡA),碰撞能量为20V;m/z823.09/643.17(GRg1),碰撞能量为35V;m/z426.20/147.0(多潘立酮),碰撞能量为35V;m/z716.81/518.83(SAB),碰撞能量为14V;m/z293.95/249.85(双氯芬酸钠),碰撞能量为10V。
 
  3结果
 
  3.1专属性考察
 
  取大鼠空白血浆或脑匀浆、大鼠空白血浆或脑匀浆加对照品和内标、给药后的大鼠血浆或脑匀浆(加内标),按2.2项下操作,色谱图见图1,结果表明,血浆和脑组织中内源性杂质不干扰待测物和内标的测定,方法专属性良好。
  3.2线性范围及定量下限考察
 
  取对照品储备液、大鼠空白血浆以及空白脑匀浆,通过倍比稀释得到标准血样和脑组织匀浆样品,按2.2项下样品前处理后进行分析,以被测化合物的峰面积(Y)对其在血浆或脑匀浆中的浓度(C)用加权(1/C2)最小二乘法进行回归运算,所得TSⅡA,SAB,GRg1在大鼠血浆及脑匀浆中的标准曲线方程、线性范围、相关系数以及定量下限见表1。试验以S/N≥10作为定量标准。
  3.3 精密度及准确度试验
 
  取空白血浆和空白脑匀浆90μL或180μL,分别加入不同浓度的TSⅡA,SAB,GRg1对照品溶液10μL或20μL制备低、中、高质量浓度(TSⅡA血浆质量浓度为10,80,800μg·L-1;SAB血浆质量浓度为10,32,320μg·L-1;GRg血浆质量浓度为2,16,160μg·L-1;TSⅡ脑匀浆质量浓度为0.1,0.8,8μg·L-1;SAB脑匀浆质量浓度为10,32,320μg·L-1;GRg脑匀浆质量浓度为2,16,160μg·L-1)的QC样品,按2.2项下方法处理,每个浓度点5个样品,依法与标准曲线同批测定,连续测定3批(分别于3d内完成),用随行标准曲线计算QC样品的浓度。据此求算方法的准确度和精密度。结果表明,血浆中TSⅡA日内、日间准确度分别为91.60%~93.14%(RSD≤4.1%,n=5),89.74%~91.48%(RSD≤5.8%,n=15);脑匀浆中TSⅡA日内、日间准确度分别为95.20%~104.2%(RSD≤3.8%,n=5),102.7%~106.2%(RSD≤6.6%,n=15);血浆中SAB日内、日间准确度分别为99.17%~110.5%(RSD≤6.3%,n=5),102.5%~106.2%(RSD≤7.3%,n=15);脑匀浆中SAB日内、日间准确度分别为105.8%~106.5%(RSD≤3.4%,n=5),101.2%~105.2%(RSD≤8.0%,n=15);血浆中GRg1日内、日间准确度分别为101.9%~111.2%(RSD≤4.0%,n=5),96.37%~105.6%(RSD≤8.8%,n=15);脑匀浆中GRg1日内、日间准确度分别为87.42%~96.86%(RSD≤3.7%,n=5),90.31%~96.44%(RSD≤5.0%,n=15)。结果均符合生物样品分析方法指导原则的要求。
 
  3.4 回收率考察
 
  准确配制血浆或脑匀浆的低、高浓度质控(QC)样品,按2.2项下方法操作,记录待测物和内标的峰面积;同时用空白基质配制相应浓度的待测物和内标溶液进样得到的峰面积作为对照,每个浓度平行操作6份,回收率=血浆或脑匀浆样品的平均峰面积/空白基质样品平均峰面积×100%,结果用x珋±s表示,见表2。采用同样的方法考察内标多潘立酮和双氯芬酸钠在血浆和脑匀浆中的回收率,结果多潘立酮在血浆及脑匀浆中的回收率分别为(98.1±2.97)%,(100.0±1.31)%;双氯芬酸钠在血浆及脑匀浆中的回收率分别为(69.8±1.85)%,(77.5±3.85)%。
 
  3.5基质效应
 
  取空白血浆或空白脑组织匀浆和相对应体积的纯水,按2.2项下方法处理后,加入相应浓度的标准溶液,使得各待测组分的浓度与低、高质控样品浓度相当,每个浓度重复6次,记录空白生物基质峰面积A1和水作为基质的峰面积A2,基质效应=A1/A2×100%,结果用x珋±s表示,见表2。内标多潘立酮在血浆及脑匀浆中的基质效应分别为(102.2±1.59)%,(83.4±0.520)%;内标双氯芬酸钠在血浆及脑匀浆中的基质效应分别为(176.4±2.760)%,(100.3±1.930)%。
  3.6稳定性试验
 
  取空白血浆和空白脑匀浆80μL或180μL,分别加入不同浓度的TSⅡA,SAB,GRg1对照品溶液制备低、高浓度的QC样品,并置于以下4种条件下考察其稳定性:①QC样品于室温放置6h后处理进样结果显示在血浆及脑匀浆中各药物的准确度为-12.5%~6.34%;②将QC样本反复冻融3次后处理进样,结果显示各药物的准确度为-5.80%~13.9%;③将QC样品按2.2项下方法处理后,置于4℃放置24h后进样,结果显示各药物的准确度为-12.5%~8.23%;④QC样本置于-20℃下储存2周后,处理进样,各药物的准确度为-7.72%~8.65%。每个浓度点平行制备3份。结果表明血浆样本和脑匀浆样本在上述的4种处理条件下均稳定。
 
  3.7 稀释方法学试验
 
  配制高于定量上限的TSⅡA,SAB,GRg1大鼠血浆样本,分别测定稀释8倍、3倍、8倍后的样品,用实测值乘以稀释倍数后,计算浓度是否为标示值的85%~115%。结果显示TSⅡA稀释8倍、SAB稀释3倍、GRg1稀释8倍不会影响测定的准确度。
 
  3.8 血浆及脑组织药动学研究
 
  所取血浆样本和脑匀浆样本分别按2.2项下方法处理,按2.3.1项下条件测定,记录各检测成分和内标的峰面积,代入回归方程,计算大鼠给药不同时相TSⅡA,SAB,GRg1的血药浓度和脑组织浓度。所得数据用PhoenixWinNolin6.1药动学程序软件进行非房室模型拟合,采用统计矩法计算药动学参数。各被测成分平均血药浓度-时间曲线、平均脑组织药物浓度-时间曲线见图2,主要药动学参数见表3。
 
  
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