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超高效液相色谱在现代药代动力学中的应用

2020-09-04 10:34 出处:未知 人气: 评论(0
  摘要以小颗粒填料(粒径小于2μm)和超高压系统(压力大于105 kPa)为特征的超高效液相色谱(UPLC)是液相色谱领域的新热点之一,它能够提供更加高效和快速的色谱系统。本文介绍了UPLC的原理、优点及其目前存在的局限性,综述了UPLC及其联用技术在现代药代动力学中的应用及其前景。
 
  关键词超高效液相色谱;药代动力学;体内药物分析;中药
 
  药代动力学是定量研究药物体内过程及其规律的一门学科[1],同时已广泛拓展到药物体内整个处置过程(ADME)的机制性研究、复杂药物体系的相互作用及药物作用物质基础的动态研究等方面。药代动力学的迅猛发展得益于分析手段的进步,同时也对分析技术提出了更高的要求。如今,药物分析正面临着前所未有的压力:样品的复杂度越来越高,样品量越来越庞大,对高通量、高灵敏度、高分离度的现代仪器分析手段的需求越来越迫切。
 
  2004年3月,Waters公司率先推出了第一台商品化的超高效液相色谱系统(Acquity,UPLCTM)。超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography,UPLC)是指一种采用小颗粒填料色谱柱(粒径小于2μm)和超高压系统(压力大于105 kPa)的新型液相色谱技术,能显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度,同时大大缩短分析周期[2],因此特别适用于微量复杂混合物的分离和高通量研究。问世3年来,UPLC与MS、MSn等设备的联用技术发展很快,现已成功应用于农药残留物检测[3,4],水质和环境监测[5,6],化妆品质量控制[7],药物及制剂的分析检测和质量控制[8-11],中药复杂组分分析[12-14]及代谢组学[15-18]等领域。本文将从UPLC的原理及优点出发,综述UPLC及其联用技术在现代药代动力学中的应用,讨论目前UPLC存在的局限性,并对其进一步应用进行展望。
 
  1UPLC的原理及优点
 
  1.1UPLC的原理
 
  UPLC保持了传统HPLC的基本原理,但是其分离效能和分析速度却得到了全面提升,这归功于其独特的小颗粒色谱填料技术。在HPLC的速率理论中,Van Deemter方程可简化表达为[19]186-187:
 
  H=A+B v+Cv(1)
 
  其中:H为理论塔板高度;v为流动相的平均线速度;A、B、C为常数,分别代表涡流扩散项系数、分子扩散项系数和传质阻力项系数,其中各项均与固定相粒度(dp)相关,如仅考虑dp对H的影响,(1)式可以表示为:
 
  H=a(d)+b u+c(d)2 v(2)
 
  p p
 
  由此可见,dp是影响色谱柱性能最重要的因素,随着dp的减小,H也减小,柱效提高。而Villiers等[20]通过大量的实验证明,随着dp的减小,H-v曲线的最低点范围也扩大,这样在一定范围内提高速度将不会损失柱效,有可能得[19]14到既高效又高速的理想系统。然而据Darcy公式,流动相通过色谱柱后其压力的升高程度(ΔP)与流动相黏度(η)、柱长(l)及流动相线速度(v)成正比,而与比渗透系数(k)及d2成反比。所以随着d的减小,压力将成倍地增加,因此超高的工作压力成为UPLC的必然选择。
 
  ηl v
 
  ΔP=2(3)
 
  k0 dp
 
  所以,减小色谱柱填料的粒径只是UPLC的一个方面,而且这种填料还必须具备高度的稳定性和耐压性,另外需要与之匹配的耐高压色谱溶剂管理系统、能够缩短进样时间的快速进样装置、能够检测极窄色谱峰的高速检测器,以及经过优化能够显著减少柱外效应的系统体积等诸多条件的保障[21],才能充分发挥小颗粒技术优势,使UPLC从理论上升为现实。
 
  1.2UPLC的优点
 
  1.2.1提高分析速度通过减小dp能提高最佳线速度,而不影响柱效,同时可以按比例缩短色谱柱的长度提高分析速度。如Nguyen等[22]采用UPLC(1.7μm固定相色谱柱)
 
  分析4种尼泊金酯类同系物,其分析速度比同样性质而粒径为5μm的色谱柱提高8倍,而分离度保持不变。Leandro等[4]采用UPLC联用质谱极性切换技术在7 min内成功分离出52种食物中的农药残留物。
 
  1.2.2提高分离度根据等度液相色谱分离度(R)方程,
 
  R受n(理论塔板数)、选择因子(α)和容量因子(k)的控制:
 
  nα-1 k
 
  α1+k
 
  因此,随着dp的减小,n增加,则R也增加。如Johnson和Plumb[23]采用UPLCoa-TOF MS检测人尿液中的对乙酰氨基酚代谢物,其平均峰底宽度由传统HPLC的4.8 s缩短为
 
  3.0 s,而且分离出的代谢物数量大大增加。
 
  2.1.1提高检测灵敏度浓缩样品和采用各种高灵敏度的检测器都能提高灵敏度,而在UPLC中通过减小d p,有效地降低了H,使色谱峰变得更窄,信噪比增大(S N),灵敏度得到额外的提高。如Yu等[24]采用UPLC MS MS分析大鼠血浆中的混合药物时灵敏度提高了5~10倍。
 
  1.2.4提高质谱离子化效率减小基质效应LC-MS已经是液相色谱发展的主流,能够充分发挥LC高分离度和MS高灵敏度的优势,UPLC与MS的联用使这种优势更加明显:一方面,UPLC系统(2.1 mm ID色谱柱)达到最佳线速度时其流动相流速一般在0.25~0.50 mL min之间[22],这与质谱能承受的流速更加匹配(API接口一般能承受0.20mLmin[25]),使离子化效率增加,而新的nano UPLC的流量更可低至200 nL min,可以不需分流而直接进入质谱[26];另一方面,UPLC的分离度比传统HPLC有很大提高,其色谱峰扩展很小,峰浓度很高,这样不但有利于化合物的离子化,同时有助于与基质杂质分离,在一定程度上能降低基质效应,从而使灵敏度和重现性得到提高[2]。如Petrovic等[5]在测定废水中的残留药物时发现,使用UPLC-Q-TOF MS(ES+ES-)可以有效减小基质效应,与HPLC-Q-TOF MS相比,多种待测物组分的响应值均有所提升,其中阿替洛尔的响应值甚至提升了1倍左右。
 
  由于UPLC与传统的HPLC基于相同的分离原理,因此仅需通过简单的转换即可实现“无缝对接”[2]。总之,UPLC与传统的HPLC技术相比,能大幅度改善液相色谱的分离度、样品通量和灵敏度,使液相色谱的分离能力得到进一步的延伸和扩展,极大地提高分析工作的效率和质量。
 
  2UPLC及其联用技术在现代药代动力学研究中的应用
 
  现代药代动力学的发展已经超越了传统意义上对药物的吸收、分布、代谢和排泄过程和规律的研究,学科间的交叉和渗透促使药代动力学向更深层次发展:从西药到中药,从研究纯化合物的药代动力学到研究多组分的药代动力学,从单纯研究母体化合物的动力学性质到研究相关代谢产物的形成机制等等,药代动力学正经历着一个由简单到复杂的发展过程,这不仅需要理论上的不断创新还需要强大的分析技术手段来实现。UPLC及其联用技术具有卓越的分离性能和高通量的检测水平,能够充分适应现代药物代谢动力学的新发展,成为推动其进步的动力之一。
 
  2.1复杂生物基质中痕量药物的测定及药代动力学研究
 
  目前,新开发的药物效应越来越强,剂量越来越低,如地氯雷他定(desloratadine)是一种新型长效组胺H1-受体拮抗剂,以5 mg d的剂量连续给药10 d,病人的平均血药浓度峰值仅有4 ng mL,Shen等[27]采用正交固相萃取法和UPLC MS MS(API+)联用测定了地氯雷他定及其主要代谢物3-羟基氯雷他定。地氯雷他定的线性范围为0.025~10 ng mL,最低定量限(LLOQ)为0.478 pg,3-羟基氯雷他定的LLOQ为0.525 pg,分析周期不足2 min,仅为HPLC的1 2,且明显优于HPLC MS MS在相同模式下测得的LLOQ(分别为0.955 pg和1.05 pg)。而Ma等[28]建立的测定人口服给药后血浆中氨氯地平的UPLC MS MS(ESI+)方法能够测得的LLOQ仅为0.75 pg,而且氨氯地平与内标物尼莫地平均无明显的基质效应影响。
 
  Li等[29]建立了同时检测人血浆中的表柔比星(epirubi-cin)及其侧链脱羰基代谢产物表柔比星仲醇(epirubicinol)的UPLC MS MS(EI+)方法。此法的分析周期不足4 min,且连续进样300次后表柔比星的保留时间仅漂移0.02 min(1.88 min※1.86 min),无明显压力升高,稳定性较好。A-l Dirbashi等[30]使用液液萃取和UPLC MS MS(ESI+)分析人血浆中的多沙唑嗪(一种选择性α1受体拮抗剂),其LLOD(S N=3)约为0.02 ng mL,灵敏度优于HPLC-FD(荧光检测法),而分析时间却由15 min缩短为2 min。Apollonio等[31,32]将UPLC与MS联用,用于分析血浆中的多种毒物成分,在分析时间和分离度上也都明显优于传统的HPLC。
 
  与体外药物通透性研究的高通量相比,样品的分析检测速度则相形见绌,UPLC的高通量分析能力为研究者开拓了视野。Mensch等[33]尝试将UPLC MS MS(ESI+)技术应用于药物开发早期的通透性评价中,不但得到了4倍于LC MS方法的高通量,而且分析方法的稳定性极佳,卡马西平第200次进样和第5 000次进样的保留时间仅漂移0.03 min(0.47 min※0.50 min)。
 
  2.2代谢通路及结构确证
 
  通过体内外代谢研究,可以确定药物的主要代谢方式、代谢途径及主要代谢产物,并在此基础上对原型药物及其代谢物的活性和毒性进行分析和比较,阐明药效或毒性产生的物质基础,为药效学和毒理学评价提供重要的依据[1],从而为创新药物的开发和筛选提供线索,对药物及其代谢物的毒性进行更为全面的评价。UPLC应用于代谢物分析还处于起步阶段,但是正如预想中的那样,通过与TOF MS、MS MS等检测设备的联用,UPLC在代谢物分析方面的能力达到甚至超越了已经获得普遍认可的HPLC。
 
  Plumb等[34]在研究大鼠给予咪达唑仑(5 mg kg)1 h后胆汁中的代谢物时发现,m z为548的[M+H]+可能是咪达唑仑羟化合并O-甲基化再与葡萄糖醛酸结合的产物,但是咪达唑仑有两个羟化位点(α-碳原子和4-号位),所以m z为548的[M+H]+极有可能是一对同分异构体。在使用HPLC-TOF MS(ESI+)分析时只能看到一个化合物峰,而同样的样品用UPLC-TOF MS(ESI+)分析时这对同分异构体却能够达到基线分离。Johnson和Plumb[23]在检测健康志愿者口服对乙酰氨基酚(500 mg)1 h后尿液中的代谢物时发现,当进样量均为10μL时,使用UPLC-TOF MS能检测到更多的代谢物,其中包括2个S-半胱氨酸结合物,2个葡萄糖
 
  醛酸结合物和1个可能产生潜在毒性的谷胱甘肽结合物。Johnson认为UPLC在灵敏度和分离度上比HPLC更有优势,其平均基线峰宽仅为3 s,窄于HPLC的4.8 s,而峰高却高3倍。Giri等[35]使用UPLC-TOF MS研究小鼠灌胃(±)1-氧化槟榔碱(20 mg kg)后0~12 h尿液中的代谢物,并对13个代谢物进行了鉴定,并绘制了较为详尽的代谢物图。UPLC-TOF MS在研究体外实验的代谢产物[36,37]以及内源性代谢产物[38]时也得到了令人满意的结果。
 
  在使用UPLC MS MS测定代谢物时,Wang等[39]测定了体外实验样品中的睾酮(T)及其4个羟化代谢产物:6β-OH-T,16α-OH-T,16β-OH-T和2α-OH-T,4个代谢物和原药均能良好分离,总分析耗时不足4 min,LLOQ均为0.01μmo l L。居文政等[40]也使用UPLC MS MS测定了灯盏花乙素在胃肠道的代谢物。
 
  2.3中药药代动力学
 
  中药药代动力学是揭示中药作用物质基础的有力手段,对阐明和揭示中草药作用机制及其科学内涵、设计及优选中草药给药方案,促进中药新药开发和剂型改进及质控,推动中医中药走向世界,并最终实现中药现代化具有重要意义。然而中药有效成分极其复杂而且又往往以组方应用,真正产生药理作用的可能是中药单体,也可能是各个组分协同作用的结果,或者是各组分相互作用后产生的新物质。如此复杂的有效成分,而且含量差距又很大,使得中药多组分药代动力学研究困难重重。
 
  UPLC具有的高灵敏度、高分离度、高通量的特点使其在复杂体系中药分离中发挥了巨大的优势。金高娃等[12]采用UPLC成功分离了赤芍、连翘、桂枝、延胡索以及丹参提取物中的复杂成分,这也给了研究者以启示:如果将UP-LC应用于中药药代动力学研究中,其卓越的色谱性能必将推动中药药代动力学和多组分药代动力学的飞速发展。遗憾的是,由于这项技术尚未普及,采用UPLC及其联用技术研究中药有效成分的代谢动力学尚处于起步阶段。目前,仅见灯盏花乙素[40]和1-氧化槟榔碱[35]体内代谢研究的报道,尚未见中药多组分药代动力学研究的相关报道。然而,随着UPLC的普及应用和分析方法的进一步完善,相信UP-LC将在这一领域大展宏图。
 
  3UPLC的局限性
 
  尽管UPLC能显著减少复杂样品的分析分离时间,提高检测的灵敏度和分离度,但目前UPLC的使用仍然存在局限性,其普及应用可能仍然需要一些时间。
 
  3.1与UPLC匹配的色谱柱比较少
 
  UPLC是应小粒径(小于2μm)柱填料的需求而专门设计的耐高压液相色谱系统,因此使用小粒填料的色谱柱能够最大限度地发挥UPLC高分离度和高灵敏度的优势。但是这种色谱柱要能够耐受由于粒径减小而带来的高反压,而且粒径的减小也给色谱柱充填技术带来了挑战。作为首家UPLC仪器开发商的Waters公司目前也只能提供有限型号的色谱柱(BEH C18 ACQ,BEH Shield RP18 ACQS,C8和苯基键合固定相等)[41]。可喜的是,各大公司已在努力开发小粒径填料色谱柱,Nguyen等[22]比较了已经上市的粒径小于2μm的色谱柱性能,如Agilent公司的Zorbax Eclipse XDB C18(1.8μm),Zorbax Extend C18(1.8μm),Zorbax Stable Bond C18(1.8μm)以及Thermo Electron公司的Hypersil GOLD C18 HYP(1.9μm)等等,这些色谱柱都能够发挥小粒径填料的优势,且各有所长。随着色谱填料技术的不断革新,UPLC色谱柱型号缺乏的问题应该是可以克服的。另外,由于UPLC超低的系统体积,即使配合使用普通的HPLC色谱柱(如5μm)分析速度也会有很大提高,而峰形和分离度也有一定程度的改善[21]。
 
  3.2峰面积的重复性欠佳
 
  Nováková等[9,10]发现UPLC分析样品时峰面积的重复性略逊于HPLC,特别是低浓度样品时更加明显,其峰面积重复性的RSD约为HPLC的2倍。研究者认为可能是由于UPLC的进样量过少(只有2μL),或者是由于采用了半环(partial loop)进样的方式,理论上这种进样方式的精密度不如全环(full loop)进样。通过稀释样品增加注入样品的体积可以改善这种状况。
 
  3.3对高频检测仪器的需要
 
  UPLC分离样品色谱峰扩展很小,通常峰底宽度只有几秒种,低浓度的样品峰则更窄。O′Connor等[37]发现使用UPLC测定低浓度样品时准确度精密度都比较差。这可能是由于检测仪器探测频率比较低,在检测低浓度样品时出现了样品点的遗漏。因此,随着UPLC的开发应用,必将推动高频检测仪器的进一步发展。
 
  4展望
 
  UPLC的出现为现代药代动力学的发展创造了新的契机,它本身具有高通量、高灵敏度和高分离度的特点,在与MS、MS MS、MSE以及TOF MS等先进检测技术联用后,尤其适用于分析复杂基质中微量甚至痕量的组分,能够满足现代药代动力学对高效能分析仪器的迫切需要,为现代药代动力学的发展提供更加强大的分析平台。
 
  然而UPLC的应用仍然存在一些局限性,但是这些不足并不是由于UPLC本身的缺陷,而是由于相关的配套技术相对滞后于UPLC的发展造成的。我们期待技术进步能够不断推动诸如柱填料技术、进样技术和高频检测器的进一步发展,使之与UPLC更加匹配,促进UPLC能够早日普及应用,使更多的研究者从中受益。
 
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