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大鼠血浆中甲硝唑 LC-MS/MS 含量测定方法的建立

2020-08-07 11:30 出处:未知 人气: 评论(0
  关键词:甲硝唑;血浆;UFLC-MS/MS
 
  1引言
 
  甲硝唑主要用于治疗肠道和肠外阿米巴病,目前还广泛用于厌氧菌感染的治疗,也可用于口腔厌氧菌感染[1]。目前测定血药浓度的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[2],HPLC法血浆处理较为繁琐且测定周期长,采用高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)测定血药浓度的报道较少[3,4],而高专属性、高灵敏度、分析时间短的血药浓度测定方法显得尤为适用,因此本试验主要建立LC-MS/MS法测定人血浆中甲硝唑的浓度,以期为其体内药物分析提供快速简单的方法。
 
  2实验部分
 
  2.1仪器与试药
 
  UFLC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司);API3200三重四极杆串联质谱仪(美国应用生物系统公司);高速离心机(上海安亭科学仪器厂);超声波清洗器(奥特赛恩斯仪器有限公司);涡旋混匀器(金坛市金城教学仪器厂)。
 
  乙睛、甲醇(色谱纯,德国MERCK公司);甲酸(批号14117,色谱纯,美国DIMA公司);灭菌注射用水(批号110128112,西安京西双鹤药业有限公司);甲硝唑标准品();甲硝唑片(批号101108,山西津华晖星制药有限公司)。
 
  2.2实验动物
 
  健康雄性Wister大鼠7只,体重180~220g(购于中国上海斯莱克实验动物有限责任公司。实验前一晚禁食,分别将0.0167g(约含甲硝唑15.32mg)甲硝唑片剂粉末用水溶后,灌胃给药,于给药前(0h)及给药后2h、8h和12 h由眼眶后静脉丛取血0.3 mL,迅速加入盛有肝素的0.5 mL塑料离心管中,4000 r·min-1离心5 min,取血浆于-20℃贮存,待用。
 
  2.3色谱质谱条件
 
  色谱柱:Shim-pack XR-ODS柱(3.0mm×75mm,2.0μm),流动相:乙腈-水-甲酸(90:10:0.2,v/v/v),流速:0.40mL·min-1,柱温:25℃,进样量:10μL,整个分析流程用时3.0min。质谱采用ESI正离子多反应(MRM)方式检测;喷雾电压(IS):4500 V;雾化温度(TEM):250℃;甲硝唑检测离子对m/z:172.0→127.8,碰撞诱导解离电压(DP):22psi;碰撞能量(CE):17psi。
 
  2.4标准曲线的制备
 
  称取甲硝唑对照品0.0020 g于10 mL容量瓶,乙醇溶解并定容,得200μg·mL-1甲硝唑标准溶液作为储备液。将储备液用大鼠空白血浆依次稀释成浓度分别为25、50、100、250、500、1000、2500、5000、10000、20000、40000 ng·mL-1的血浆溶液,即得系列标准曲线浓度。
 
  2.5血浆样品处理
 
  准确吸取30μL血浆置于0.5mL塑料离心管中,加入75μL乙腈,涡旋振荡1min,13000 r·min-1高速离心5 min后取上清于进样瓶,进样量10μL。
 
  3结果
 
  3.1方法的专属性
 
  按检测条件及血样处理方法分析了空白血浆样品、配置的含药物的血浆样品以及大鼠血浆样品。结果表明,血浆中杂质不干扰样品的测定。甲硝唑的保留时间为1.10 min,表明本法具有较强的专属性。
 
  3.2线性关系考察
 
  按样品处理项下操作,以甲硝唑峰面积对浓度作线性回归,得典型标准曲线方程:y=176x-160,r=0.9994。甲硝唑浓度在25~40000ng·mL-1范围内线性良好。以标准曲线线性范围的最低点浓度作为定量限,则最低定量限为25ng·mL-1(S/N>10)。
 
  3.3提取回收率
 
  分别配制低、中、高3种浓度(40、1000、36000ng·mL-1)的标准血浆溶液,按血样处理方法项下进行操作,结果低、中、高3个浓度的提取回收率分别为100.00%、95.63%、97.55%,RSD分别为8.96%,6.81%,1.84%。
 
  3.4精密度和准确度考察
 
  同上配制低、中、高浓度的甲硝唑血浆样品,按照“血浆样品处理”项下平行操作,于日内分别测定5次,用工作曲线计算浓度,考察方法日内精密度;日间分别进行分析,连续测定3d,考察方法日间精密度,计算日内和日间RSD,结果均小于7%,符合要求。
 
  3.5稳定性试验
 
  同上配制1000 ng·mL-1的甲硝唑血浆样品,分别于配制后24h、3次反复冻融、4℃下保存一个月后取出依法测定。其RSD%分别为5.52、5.02、6.13%,说明样品在上述条件下稳定。
 
  4结论
 
  本实验所述方法具有简单可靠、准确灵敏、快速高效的优点,并且重复性好,辅料未见干扰。与紫外和液相法相比,本方法更加准确、专属性好、减少了操作误差,且取样量少,适用于甲硝唑体内药物分析。
 
  参考文献:
 
  [1]Jihye Kim,Jaeyoung Chun,Jae Yong Park,et al.Intest Res.2017,15(1):124–129.
 
  [2]Mansoure Masoudi,Mahmoud Rafieian Kopaei,Sepideh Miraj.lectron Physician.2016,8(8):2818–2827
 
  [3]John E.Mazuski,Leanne B.Gasink,Jon Armstrong,Helen Broadhurst,Greg G.Stone,Douglas Rank,Lily Llorens,Paul Newell,Jan Pachl.Clin Infect Dis.2016,62(11):1380–1389.
 
  [4]Philip T.Cherian,Xiaoqian Wu,Lei Yang,et al.J Antimicrob Chemother.2015,70(11):3061–3069.
 
  [5]Tran Thanh Binh,Rumiko Suzuki,Tran Thi Huyen Trang,et al.Search for Novel Candidate Mutations for Metronidazole Resistance in Helicobacter pylori Using Next-Generation Sequencing.2015,59(4):2343–2348.
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