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高效毛细管电泳在临床体液中药物分析的应用

2020-08-07 11:05 出处:未知 人气: 评论(0
  高效毛细管电泳(HPCE)是以高电场为驱动力,在细内径毛细管内带电荷粒子按其淌度或分配系数的不同而进行分离的一种电泳新技术。由于其分离效能高、分析速度快、样品用量少,在中药成分[1]、抗生素[2]、生物大分子[3]等分析方面应用较广,近来在体内药物分析中的应用逐渐增多。
 
  1基本原理
 
  HPCE主要的分离模式[4]分为毛细管区带电泳(CZE)、胶束电动毛细管电泳(MECC)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管等电聚焦电泳(CIEF)、毛细管等速电泳(CITP),而CZE和MECC是体内的药物分析中最常用的2种模式。CZE是在毛细管内进行的自由溶液电泳,毛细管内充入具有一定缓冲能力的背景电解质,被分离组分可为正、负离子,它的迁移速度等于其电泳淌度和电渗淌度的矢量和。MECC是既能分离中性化合物又能分离带电组分的分离模式,是由CZE派生而来的。与CZE不同的是在电解质中加入超过临界胶束浓度(CMC)的表面活性剂使之在溶液中形成胶束。在电泳过程中,这些胶束按其所带的电荷朝着与电渗流(EOF)相同或相反的方向迁移,组分在受电场作用下,依据其电泳淌度和分配行为的不同而进行分离。
 
  2样品的前处理
 
  HPCE法对样品的预处理的要求较色谱法低,但样品仍需预处理后方能进行分析。常见的样品有血浆、血清、尿液和头发等,样品的预处理主要分为萃取法和直接进样法两大类。直接进样法是HPCE法的特点之一,一般为经过蛋白沉淀、离心过滤,最后进样。萃取法主要有液相萃取和固相萃取法,这2种萃取方法都适用于基质干扰较大,待测组分数量较多,尤其是含脂溶性成分较多的样品。
 
  2.1液-液萃取主要采用有机溶剂如乙酸乙酯[5]、
 
  氯仿[6]、乙醚[7]、二氯甲烷[8]等将血清或血浆中的药物提取,分取有机相后,在N2流作用下吹干,残渣用缓冲溶液溶解,然后过滤进样。经典的液-液萃取法,消耗有机试剂较多,而采用载体液膜法[32](sup-ported liquid membranes,SLM),只需极小量有机试剂。先将样品溶液调节至中性,然后使其通过固定在多孔膜的有机溶剂而进入具有适当pH值的水溶液中,被分析物以离子形式存在,不会再返回膜内,SLM法可选择性地使被分析物从复杂的生物样本中提取出来。
 
  2.2固相萃取液相萃取法具有样品需要量大,有机溶剂消耗大等不足,固相萃取则需样品少,提取效率高,杂质干扰少。这是固相萃取被更多采用的原因。固相萃取法一般常用ODS柱[10]、Sep-pakC18柱[11]和Bond-Elute LRC柱[12]。例如:分离尿液中的阿替洛尔、氢氯噻嗪、阿米洛利时,选择Bond-E-luteC18萃取柱,先将固相萃取柱用甲醇、0.1 mol·L-1磷酸缓冲液活化,然后用洗脱液乙酸乙酯-异丙醇(8∶2,含2氨水),将尿样从固相柱上洗脱出来被分析物,再经过处理进样。
 
  也有将液-液萃取与固相萃取相结合,这样消除样本中杂质同时,可以提高检测灵敏度,如测定血清中R-和S-司可巴比妥[33]的含量就采用此法。其最低检测限(LOD)达到1μg·mL-1。
 
  3各种药物的HPCE法体内分析
 
  3.1化学药物化学药物在HPCE应用方面最为广泛,见表1。阿昔洛韦[18],加巴喷丁[19]、华法林[8]等在体液中都达到较好的检测目的。在优化色谱条件时,常加入有机溶剂添加剂如2-丙醇[5]、甲醇[14],以改善待测组分的分离;加入手性添加剂,如甲基-β-CD[8],丁磺基-β-CD[20]以适用手性药物的分离。
 
  滥用药物滥用药物分析曾采用的主要方法是:气相色谱(GC)、气质联用(GC-MS)、HPLC和酶联免疫分析技术(EMIT),将HPCE用于滥用药物分析在毒品检验、戒毒工作方面有独特的优势。有些吸毒者虽然在短期内停止吸毒,在尿样或血清中检测不出毒品,但对于它们头发中痕量[21]可卡因、吗啡,仍可用CZE检测出,以确定其有无吸毒史,见表2。

  3.3抗菌药物体液中抗菌药物浓度的测定传统上采用微生物法,虽然具有设备简单,样品无需预处理等优点,但专属性较差,只能测定出抗菌药物的总效价而不能区分出抗菌药物的活性代谢物。而HPCE可以克服上述缺点,而且分离效率较高。如测定尿液中氧氟沙星[20]可得到理想的结果,见表3。
  同时测定阿莫西林降解产物和杂质时,曾将MECC法和CZE法2种模式相比较,在运行缓冲液中加入不同浓度的SDS(0.50,75,150 mmol·L-1)后,阿莫西林的保留时间随着SDS的增大而逐渐延长,但峰形和灵敏度相近,这时因为在pH为9的电解质中,阿莫西林带负电荷,其分离受SDS的影响小,而采用CZE是最简单的分离模式。
 
  3.4生化药物生化药物在体内的分析报道还较少,见表4。
  4 HPCE法和HPLC法在体内药分中应用的比较
 
  HPCE法与HPLC法的优缺点见表5,第2,3,4,5条与体内药物分析的要求一致,因为血浆、血清、尿液等杂质很复杂,即使经过前处理,也难免带有其他混合物,用HPLC分析时,色谱柱易受污染且难以再生,而HPCE法适用,因为毛细管极易清洗,尤其对于复杂生物样品,即使经过去蛋白或SPE等处理,也有可能带入内源性干扰物质。当分析完毕,或是样品测定间隔,一般采用浓度为0.1mmol·L-1的氢氧化钠溶液、重蒸水冲洗几分钟,就可除去吸附在毛细管内壁的物质。第5,6,7条显示HPCE在经济上的优势,第8,9,10条是HPCE差于HPLC的方面,其中定量精密度和检测灵敏度是长期困扰HPCE的2个障碍。对于定量,采用内标法,HPCE的性能与HPLC不相上下,如测定小鼠尿液、血浆中的碘他拉酸盐(iothalamate)[23],内标为氨基苯甲酸。药物在1.25~200μg·mL-1线性较好,r=0.999 6。测定低浓度碘他拉酸盐时,5份样品的准确度为98.0,RSD为6.4,测定高浓度时,准确度为99.7,RSD为0.8。
  HPCE另一个优势就是能同时检测出理化性质差异较大的药物,而HPLC用一根色谱柱只能分离性质相近的药物。烟酸(nicotinic acid)属于亲水维生素B族药物,它在体内有2条代谢途径,分别产生7个谢产物,代谢产物在体内有一定的毒理作用。采用梯度洗脱HPLC法最多可同时测定4~7个产物,而用HPCE法同一系统则能同时测定烟酸及全部代谢产物,为研究烟酸的低脂血活性和测定不良反应机制提供了快速的检测方法。
 
  随着HPCE的不断完善,提高灵敏度的措施也愈来愈多,如样品前处理采用SPE法[5](阿替洛尔LOQ为0.6μg·mL-1),采用场放大进样技术[11](field-amplified sample injection)(阿莫西林LOD为280μg·L-1);检测器用激光诱导荧光检测器(LIF)[24](柔红霉素LOQ为2μg·L-1)等。HPCE前处理简单,分析时间短,非常适合临床体内药物监控。当精密度和灵敏度问题逐步改进后,HPCE法的应用范围将愈来愈广。
 
  5毛细管电泳新技术在体内药物分析中的应用
 
  非水毛细管电泳技术[13]是新发展起来的电泳技术,它是以非水溶剂作为电泳介质,扩展了毛细管电泳技术的分析对象,使疏水化合物也能用毛细管电泳技术分析。其优势是:在较多的运行电压下不产生明显的焦耳热,提高分离效能,非水溶剂可减少疏水化合物与带负电荷的毛细管内壁的相互作用,从而减少吸附,在检测方面,可与质谱检测器、激光诱导荧光检测器等高灵敏度检测器连用。由于其独有的优势,近来,非水毛细管电泳技术在生物样本中药物及代谢物的分析已成为研究的热点。见表6。
  6HPCE在体内药物分析应用展望
 
  目前,体内药物分析中治疗药物检测、滥用药物测定分析方法主要还是应用HPLC,但采用HPLC法时样品预处理既费时又费力,平衡时间和分析时间较长,试剂耗费多;从发展趋势看,HPCE具高效、廉价、环保之优点,适于普及。医药领域内大量研究工作已经表明HPCE已经走向成熟,将其与各分支技术的联用及同质谱的联用[36],将能扩大其使用范围。
 
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