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药母灌胃大鼠血清中药物化学成分初步研究

2020-07-31 10:18 出处:未知 人气: 评论(0
  [摘要]目的:研究药母灌胃大鼠血清中药物化学成分。方法:20只SD大鼠均分为空白组和药母组,药母组SD大鼠使用400 g/L的药母提取液按1.37 g/kg进行灌胃,空白组灌胃同等体积的蒸馏水,连续给药3 d,收集两组大鼠血清;利用超高压液相色谱-飞行时间质谱(UHPLC-Q-TOF)技术检测药母提取物、药母组及空白组大鼠血清的指纹图谱,比较3种指纹图谱异同,分析药母灌胃大鼠血清中的移行成分。结果:药母灌胃后大鼠血清中在正负模式下共发现30个药源性成分,其中15个原型成分,15个代谢产物。结论:灌胃后大鼠血中移行成分及代谢产物可能为药母在体内直接的作用物质。
 
  [关键词]药母;血清药物化学;指纹图谱;移行成分;超高压液相色谱-飞行时间质谱;大鼠,Sprague-Dawley
 
  传统中药多为口服给药,其有效物质必须以血液为介质输送到靶点产生作用,血清中含有的药物成分才是中药在体内直接作用的物质[1]。通过中药血清药物化学研究,确定中药在体内直接作用的物质,可为中药及其复方制剂的药效物质基础研究提供可靠的实验依据。近年来,血清药物化学(Se-rum Pharmacochemistry,SPC)的研究方法在中药研究中得到了很大的发展,涉及中药单方的有效部位、中草药药理药效的真正物质基础及作用机理等方面的研究,取得了大量有意义的结果[2-4]。药母为纯中药复方制剂化风丹组方中的君药,由牛胆水、白附子、生半夏、生南星、生川乌、郁金及神曲以独特发酵工艺制作而成,具有息风镇痉、活血止痛的功效[4]。目前,针对药母药效物质基础及其药理作用机理研究少见,药母在体内以何种成分、何种形式发挥作用,作用机理如何已成为药母深层次开发利用的技术瓶颈,对药母的血中移行成分进行详细的分析,阐明其血中移行成分、代谢产物及方剂的配伍意义,可为有效地改善药母及其制剂的生产工艺,提高制备水平,增强临床疗效提供科学依据。本研究对药母灌胃后大鼠血清中的药物化学成分进行了初步的探索,报告如下。
 
  1材料与方法
 
  1.1仪器、材料及动物
 
  Agilent 1290 Infinity UHPLC-DAD-Bruker Mic-rOTOF-QⅡ仪(美国Agilent,德国-Bruker)包括自动进样器、柱温箱、DAD二极管阵列检测器、二元泵,ZH-2涡旋混合器(天津药典标准仪器厂),DK-98-11恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司),EL204电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司),MTN-2800D氮吹浓缩装置(奥特塞恩斯仪器公司),CQ250A-TS超声波清洗机(上海跃进医用光学器械厂),Allegra64R低温高速离心机(美国Beckman)。药母(批号20150801)购于遵义廖元和堂药业有限公司,乙腈、甲醇为色谱纯,其余试剂均为分析纯。健康成年雄性SD大鼠,体质量(300±20)g,清洁级,购自重庆腾鑫生物技术有限公司,许可证号SCXK(渝)2012-0008。
 
  1.2方法
 
  1.2.1药母灌胃液的制备取药母研碎,称取40 g,加入12倍量的50%甲醇,回流提取2 h,过滤,重复提取3次,合并滤液,旋蒸回收甲醇,浓缩制备成400 g/L的提取药液,即得提取物灌胃药液,冷藏备用。
 
  1.2.2大鼠血清的制备取健康SD雄鼠20只,禁食12 h(自由饮水)后,随机分均为空白组和药母组。药母组取药母灌胃液(1.37 g/kg)进行灌胃,空白组灌胃同等体积的蒸馏水,连续给药3 d,两组分别于末次给药后1.5 h股动脉取血,置于37℃水浴至上层有黄色液体析出,5 000 r/min离心10 min分离血清,同组大鼠血清合并,以消除个体差异,置于-20℃保存备用。
 
  1.2.3供试品的制备由于含药血清包括许多内源性杂质和蛋白类成分,直接进样检测可能会干扰实验结果,并对仪器会造成污染。实验通过考察有机溶剂沉淀蛋白、乙酸乙酯萃取法、HLB固相小柱萃取法对血清样品的影响,最终选择信息量最大的甲醇沉淀法对样品进行处理;分别取药母组和空白组大鼠血清各1 mL,加入4 mL甲醇,涡旋混匀2 min,超声处理10 min,15 000 r/min低温离心10 min,取上清液置于氮吹仪中,37℃氮气吹干。再加入2 mL甲醇于吹干样品中,按上述处理方法二次沉淀蛋白,取上清液于37℃氮气吹干后,加入200μL甲醇复溶,涡旋震荡2 min,超声10 min,15 000 r/min低温离心10 min,上清液即为含药血清或空白血清样品。
 
  1.2.4分析条件色谱条件:色谱柱为Agilent E-clipse Plus Cl8RRHD(100 mm×2.1 mm,1.8μm),柱温为40℃,流动相为0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B)梯度洗脱,进样体积为2μL;梯度洗脱(0~7 min,10%B~25%B;7~10 min,25%B~45%B;10~15 min,45%B~65%B;15~18 min,65%B~100%B)。质谱条件:电喷雾离子源,扫描方式为正、负离子扫描(ESI-、ESI+,m/z 100~1 000),毛细管电压为4.5 kV,锥孔电压为150 V,离子源温度为110℃,雾化气(N2)压力为1.2 bar,流速为8.0 L/min,温度200℃,准确质量测定采用甲酸钠校正标准液,校正模式选用En-hanced Quadratic。数据用Data Analysis软件、Me-tabolite Detect软件结合文献[5-11]进行数据分析,得出药母提取液的化学成分或者药母组SD大鼠血清的化学成分。
 
  2结果
 
  2.1药母提取液的化学成分
 
  按“1.2.4”项方法取药母提取物样品液进Q-TOF-MS系统分析,以响应值(Y)为纵坐标、以保留时间(X)为横坐标,通过药母提取物正离子色谱图(图1A),质谱信息见表1;通过药母提取物负离子色谱图(图1B),质谱信息见表2。


  2.2药母组SD大鼠血清中药物的化学成分
 
  运用Metabolite Detect软件将空白组血清色谱图从药母组血清色谱图扣除,得到其差异图谱,以响应值(Y)为纵坐标、以保留时间(X)为横坐标。从药液化学成分的分析结果可以知道,药母组血清在正、负离子模式下均有响应,正离子模式下多为生物碱,负离子模式中出现15个移行成分,通过与药母提取物样品液保留时间比较,得出有6、7、9、10、12、13、14、15号峰为药母入血原型成分,其他7个色谱峰所表征的成分可能为药母提取液灌胃后在大鼠体内转化的代谢产物或机体对药物产生的应激成分,初步质谱表征数据特征见图2;药母含药血清正离子模式中出现15个移行成分,通过与药母提取物样品液保留时间比较,得出6、7、8、10、11、14、15号峰为入血原型成分,其他8个色谱峰所表征的成分可能为药母提取液灌胃后在大鼠体内转化的代谢产物或机体对药物产生的应激成分,初步质谱表征数据特征见图3。

  3讨论
 
  由于中药化学成分复杂,加之许多成分为微量成分,用常规的植化方法制备分离某些成分,不仅工作量巨大,而且其中不少还无法进行。且中药复方化学成分不只是单味药化学成分的简单组合,而是发生了变化[12]。生物样品的检测方法的建立和验证是整个血清药化实验研究的基础,而UHPLC作为高效液相色谱(HPLC)分析方法的一种突破分析方法,具有对复杂样品的超高分离能力、超高分析速度和超高分析灵敏度,极大地提高分析工作的效率和质量;而Q-TOF-MS是高分辨串联质谱,能够精确相对分子质量以及可能的分子式与结构[13]。而本研究采用UHPLC与Q-TOF/MS联用建立了一种高效、准确、快速地分析复杂中药体系化学成分的方法,充分合理地将液相色谱强大的分离能力和质谱的高分辨特点运用在复方中药体系中。正是由于UHPLC-Q-TOF-MS具有液相色谱强大的分离能力和质谱的高分辨等特点,已成为研究体内药物分析的首选方法。
 
  本研究采用正、负离子扫描方式对药母提取物样品液进行全扫描,发现药母在正、负离子模式下均有响应且成分较多,正离子模式下多为生物碱,通过比较药母提取物、两种类型的大鼠血清的指纹图谱差异,分析药母灌胃大鼠血清的移行成分,结果显示,药母灌胃后大鼠血清在正负模式下共发现30个药源性成分,其中15个原型成分,15个代谢产物。初步阐明了药母给药后部分血清化学成分,表明药母含药血清有入血成分存在,但是有很多可能为药母提取液灌胃后在体内转化的代谢产物或机体对药物产生的应激成分,从血清药物化学研究结果显示这些原型成分和代谢产物或机体对药物产生的应激成分最有可能成为药效物质基础,因此有待进一步更深入的研究入血原型成分以及各个成分在大鼠体内的代谢过程,将为明确药母药效物质基础提供了科学依据和有助于阐明药母的有效成分及其作用机理,并对指导临床用药提供重要依据。
 
  4参考文献
 
  [1]房方,李祥,陈建伟.中药血清药物化学的研究进展[J].亚太传统医药,2009(1):143.
 
  [2]刘军锋,方颖,龚占峰,等.缬草抗心律失常有效部位的血清药物化学初步研究[J].湖北中医杂志,2013(12):72-73.
 
  [3]郭立玮.中药药物动力学方法与应用[M].北京:人民卫生出版社,2002:294-296.
 
  [4]王喜军.茵陈蒿汤的生物药学研究[J].中国中西医结合肝病杂志,1998(8):10-12.
 
  [5]姜海,张颖.川乌的研究进展探讨科技向导[J].2014(9):257.
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