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分子印迹技术及其在药物分离与分析中的应用

2020-07-31 09:23 出处:未知 人气: 评论(0
  摘要:复杂体系微量药物和药物相关物质的分离与分析是药学研究领域的共性问题。建立高灵敏度、高选择性、高速度、自动化、连续化、智能化的分析技术是药物分析学科发展的重要方向。新方法的建立对于进一步了解生命过程和药物的作用、保障药品质量、提高药品疗效发挥了积极的推动作用。近年来发展起来的分子印迹技术具有构效预定性、识别特异性、长期稳定性和广泛适用性等特点,得到研究者的广泛关注。本文简述分子印迹技术的原理和制备方法,综述了分子印迹技术在手性药物分析、体内药物分析、中药活性成分和生物大分子的分离与分析等中的应用,并对其面临的问题及应用前景进行了展望。
 
  关键词:分子印迹技术;药物分离;药物分析
 
  药物与生命体的相互作用,本质上是物质间的相互作用。灵敏度高、特异性强的分析技术对于进一步了解生命过程和药物的作用、保障药品质量、提高药品疗效发挥了积极的推动作用。分子印迹技术(mo-lecularimprintingtechnology,MIT)是一种高选择性、特异性的分离和分析技术,这种技术的思想源于抗原-抗体专一性识别。基于分子识别的聚合物材料———分子印迹聚合物具有构效预定性、识别特异性、长期稳定性和广泛适用性等特点,且具有抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长等优点,使得MIT在诸多领域均展现了良好的应用前景。
 
  1原理与聚合物制备
 
  1.1基本原理分子印迹的概念是由POLYAKOV
 
  1931年提出,MOSBACH研究组在Nature上发表了茶碱和安定分子印迹聚合物的报道,引起了人们对MIT的极大关注,使得MIT得到了迅速的发展[1-2]。
 
  MIT是一个为目标分子合成人工抗体的过程。分子印迹聚合物(molecularlyimprintedpolymers,MIPs)的合成过程是以目标分子为模板(template),将具有结构互补的功能单体(functionalmonomers)与模板分子结合后,使用交联剂(crosslinker)聚合在一起,然后将目标分子去除,便会留下一系列大小、形状与目标分子相匹配的结合位点。MIPs不仅具有类似天然抗体识别的特异性、高选择性和高结合能力等特点,还具有更好的稳定性、制备过程简单并可重复使用等优点[3]。
 
  1.2MIPs的制备MIPs的制备过程如图1所示。根据模板分子与功能单体相互作用的原理不同,传统MIPs的制备方法主要包括预组装法、自组装法、结合法和金属螯合法[1]。
  然而,传统的MIPs制备方法均为不可控的自由基聚合法,这就导致MIPs存在非特异性的结合位点、结合位点分布不均一以及聚合层厚度不均一等问题。为了克服这些缺点,近几年研究人员将可控活性自由基聚合法引入到MIT中,该法通过控制溶液中参与反应的自由基的钝化,从而控制整个反应的速度和进程[4]。可控活性自由基聚合法主要包括以下几种:1.2.1可逆加成-断裂链转移聚合法(reversiblead-ditionfragmentationchaintransferpolymerization,RAFT)该法制备过程中需要有可逆加成序列的存在,通过控制该序列中活跃链和休眠链间双硫酯键的转移来控制聚合的进程。该法所得聚合物的分子量分布、分子大小和分子结构都可以实现有效控制[5]。1.2.2引发-转移-终止聚合法(initiationandtrans-ferterminationpolymerization,ITTP)该法是利用二硫代氨基甲酸盐分裂成初始化的烷基以及稳定的第二种自由基过程来制备。由于第二种自由基无法引发新的聚合链,当向该反应供给热量或者减少紫外辐射时两种自由基会重组而停止链增长,之后再进行下一次引发聚合,因此会在一定程度上实现了在线控制[6]。1.2.3原子转移自由基聚合法(atomtransferradicalpolymerization,ATRP)该法是通过可逆的氧化还原反应产生多种活性基团,经金属离子/配体复合物所催化,该催化剂则可以被从休眠态到活化态所转移的卤素原子所氧化,从而使复合物到达一个高氧化状态[7]。1.2.4氮氧自由基聚合法(nitroxidemediatedpoly-merization,NMP)该法是一个热可逆终止反应,烷氧基胺C-ON键的均裂会促使该反应的发生,从而烷基和氮氧自由基被激活,可以通过控制自由基产生的量来控制整个反应的进程[8]。
 
  2MIPs在药物分离与分析中的应用
 
  与常规的分离或分析用的色谱固定相比较,MIPs的突出特点是对目标分子具有高度的选择性,同时还具有良好的物理化学稳定性,能够耐受高温、高压、酸碱、有机溶剂等,容易保存、制备简单、易于实现规模化制备,因而得到比较广泛的应用。MIPs在药物分离与分析中主要被应用于手性药物分析、体内药物分析、中药活性成分分离与分析以及药物杂质分离与分析等几个方面。
 
  2.1手性药物分析手性药物(chiraldrug)的拆分一直是制药工业、临床药物分析和环境检测领域的研究热点。目前世界临床使用的合成药物中,手性药物占40%,且87%以上的手性药物是以外消旋体的形式出售[9]。随着对手性药物研究的不断深入,人们已经发现手性药物的药效学、药动学和毒理学可表现出质和量的区别,这就对分离手性药物的技术提出了新的要求。尽管目前已有手性合成、酶拆分以及其它的分离技术,但MIPs在分离对映体方面有独到之处,而且MIPs作为色谱固定相进行手性拆分也是MIPs早期的研究重点。目前已成功分离的手性药物见表1。
  尽管MIPs作为手性固定相已经研究二十余年,但其仍未投入商业使用,原因可能是由于MIPs手性固定相仅能针对特定手性药物进行分离,广谱适用性较差;另外,缺乏高纯度的光学异构体作为模板,也限制了其应用。
 
  2.2体内药物分析体液成份复杂,干扰物质多,而待测药物浓度一般都很低。如何方便、快捷地对样品进行预处理,将少量的目标药物从大量复杂的生物基质中分离出来,以便准确定性、定量,是体内药物分析面临的首要问题[28]。近年来,随着药物分析技术的不断提高,生物样品预处理技术得到迅速发展,并克服了传统萃取方式回收率低、繁琐费时、溶剂毒性大、易乳化等不足。其中,固相萃取技术(solidphaseex-traction,SPE)因其对目标物具有回收率高、有机溶剂用量少、无相分离操作、能处理微量样品以及易于自动化等优点而被广泛和普遍应用的样品前处理方法[29]。然而,由于常规固相萃取吸附材料(如硅胶或C18材料等)与目标分析物之间的作用是非特异性的,常常因萃取介质对目标物的选择性较差的原因,在吸附目标物的同时也引入了部分基质和干扰物,使得对目标物的分析受到干扰[30]。而分子印迹固相萃取是以MIPs为萃取介质的固相萃取技术,MIPs具有从复杂样品中特异地吸附目标分子的能力,这一性质使得MIPs非常适合作为SPE萃取介质实现对复杂样品中的目标物选择性的分离和富集[31]。
 
  自1994年SELLERGREN等[32]以戊咪为模板分子制备了MIPs并将其作为固相萃取吸附剂用于对尿液中戊咪的分离后,将MIPs与SPE结合用于对体内药物分析的研究呈现出迅速发展。分子印迹-固相萃取(molecularlyimprinted-solidphaseextrac-tion,MISPE)可用于对各种复杂样品中目标物的分离、纯化和浓缩,涉及到的生物样品包括各种体液、组织和排泄物等[33],被检测过化合物多为药物及其代谢物、毒物或其他有害物质等(表2)。
 
  2.3环境样品中药物的分离与分析鉴于环境样品中目标物的浓度低、组分复杂且易变化,因而其检测对技术的要求越来越高。MIPs用作固相萃取剂可克服环境样品体系复杂的预处理手续,为这些样品的采集、富集和分析提供极大的方便,尤其在痕量分析中发挥重要作用,毫摩尔水平下的痕量物质经这一方法预富集处理后,在色谱中则易于检出(表3)。随着MIT的不断深入和应用领域的不断拓展,MIT在环境领域定会有更广阔的应用前景。


  2.4中药活性成分的分离与分析中药是一个复杂的、结构多样性的天然组合化学库,其所含的化合物结构类型多样、量悬殊且许多成分未知,导致对中药活性成分分离和分析的难度较大[76]。目前分离和分析中药活性成分主要依赖于硅胶柱色谱(silicagelcolumnchromatography)、大孔吸附树脂柱色谱(macroporousadsorptionresincolumnchromatogra-phy)、聚酰胺柱色谱(polyamidecolumnchromatog-raphy)、凝胶柱色谱(gelcolumnchoromatography)、高速逆流色谱(high-speedcountercurrentchroma-tography)、制备型高效液相色谱(preparativehighperformanceliquidchromatography)等技术,为了更好地对活性成分进行分离和分析,常需经多种溶剂萃取和反复柱色谱,不仅溶剂消耗量大、环境污染严重,而且效率和收率也低[77]。基于MIT制备的MIPs具有亲和性强和选择性高、抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长、应用范围广等特点[78],而且MIPs具有其他分离材料所不具备的特异性和选择性,MIT将在中药目标成分的分离和分析中具有广阔的应用前景。目前用MIT研究的中药成分有黄酮类、多元酚类、生物碱类、甾体类、香豆素类和木脂素类等(表4),均取得了良好的效果。

  然而,MIPs在中药活性成分分离与分析中的应用也有一定的局限性:①有些模板十分昂贵或难于获取,且模板需用量较大,导致成本过高;②目前制备相对分子质量较大的目标物的MIPs还有一定的困难,需进一步开发中药活性成分的模板;③MIPs的吸附容量受外界条件影响较大、较不稳定,因此对目标物的回收率常出现波动;④MIPs对模板的结构类似物也会有一定的交叉识别作用,因此吸附物很难保证是单一模板化合物,吸附后还需进一步纯化等。
 
  2.5药物杂质的分离与分析药物杂质控制是药品质量研究中的一项重要内容。药物中的杂质含量低、来源广泛、结构类型多且与主成分类似,必须选择合适的分析技术进行研究[110]。MIPs的高选择性、高强度、高耐用性及可重复使用等诸多优点使得MIT在药物杂质分离和分析中也显示出良好的应用前景。
 
  NAJAFI等[111]采用MIPs-电位传感器分析吡罗昔康中的杂质2-氨基吡啶(2-AP),结果显示,该传感器对2-AP有高度识别性;HASHEMI等[112-113]制备
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