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探索色谱-质谱联用技术在中药学专业本科教学中的应用

2020-07-21 10:09 出处:未知 人气: 评论(0
  摘要:介绍了中药学专业在仪器分析本科生实验教学过程中存在的弊端,阐述了将色谱-质谱联用技术引入该课程的必要性和可行性。通过分析该课程硬件和软件建设的情况,特别是实验项目的选择、实验讲义的撰写以及授课方式等具体建设内容,建立了完善的中药专业仪器分析教学实验方案,让气相色谱质谱和液相色谱质谱支撑中药专业本科教学实验,进一步提高该类大型仪器的利用率。实践表明,该课程的开设有利于培养中药学本科生的综合实验能力和分析设计能力,提高学生的实践能力和科研水平。
 
  关键词:中药学专业;色谱-质谱联用技术;实验课程;本科生教育
 
  0前言
 
  与西药相比,传统中药疗效确切,毒副作用小,有效弥补了西医治疗过程中的不足,符合现代人的防病治病思想。中药的功效不仅取决于某个单一成分,而是多种组分相互作用的结果。因此,明确有效成分十分关键。但是,中药化学成分复杂,大部分成分与治疗效果无关,而且还干扰有效成分信息。中药种类繁多,有效成分含量差异较大。同一品种的中药,如果起源,生长环境和加工方法等不同,成分和含量也不尽相同。
 
  因此,中药有效成分分析是中药研究的首要任务,选择合适的分析方法尤为重要。
 
  药物分析中常用的分析技术包括紫外分光光度法、红外光谱法、荧光分光光度法等光谱技术,还有色谱及色谱-光谱等联用技术。但各种技术都有一定的适用范围和优缺点,中药品种众多,有效成分含量差别较大,如何根据具体药物选择合适分析方法是中药学专业本科生应该具备的能力。随着仪器检测灵敏度的提高,新方法的更新,国外仪器的引进,不同方法之间的联用,使中药分析过程中遇到的难题逐渐得到解决,从而加快推进我国中药市场化。紫外分光光度法、红外光谱法、荧光分光光度法,色谱法(气相色谱法和高效液相色谱法)等也是中药专业学生必须掌握的分析方法。然而一些简单的光谱和色谱技术面临一系列问题:样品纯度要求高,分析时间长、分离效率不高、色谱柱易污染。色谱-质谱联用技术具有强大的分离能力和结构鉴定能力,两者互取所长,使样品的分离、定量及定性成为快速准确的方法[1-4]。
 
  据了解,国内院校在中药学专业本科实验教学中开设色谱-质谱联用技术的实验不多。该类仪器不仅是进行中药专业研究的重要工具,而且也是建立相应实验课程的最好硬件资源。考虑到现代中药分析发展的需要以及专业的特点,改变了传统的教学模式,引入色谱-质谱联用技术实验,充分利用浙江省药学实验示范中心的大型仪器共享平台,积极进行教学模式的改革[5-6]。
 
  1传统的实验模式存在的问题
 
  我校药学院针对中药专业本科生开设有仪器分析实验课,其中有关色谱学方面的实验内容包括气相色谱法测丙酮的含量和高效液相色法测定苯的含量等。以气相色谱法测丙酮的含量实验为例,实验课程内容为:带教老师讲述仪器的基本结构和原理;阐述程序升温色谱技术与恒温色谱法的区别;设定试验参数;演示手动进样;面积归一法计算丙酮含量等。由于受实验条件的限制,仍然是以带教老师讲述演示为主,实验过程处于观摩状态,无法发挥学生的主观能动性和学习兴趣,学生很难做到理论联系实践,只是懂得课本上的理论而提高不了学生的独立操作能力和科研思维水平。为此将“气相色谱法测丙酮的含量”实验改为“气相色谱法测定藿香正气水中乙醇含量”。让学生查找文献或对照药典,自己设计实验,通过不同的中药选用不同的仪器进行测定。带教老师首先引导学生了解藿香正气水的基本成分和功效:其为夏季常用传统中成药,主要成分包括藿香、白术、陈皮、厚朴、白芷、桔梗、茯苓、大腹皮、半夏、甘草、紫苏等,具有散寒解表、化湿和中、祛暑的作用,可以用来治疗外感风寒、内伤湿滞引起的头痛发热、恶心呕吐、腹痛腹泻等;同时让学生明白其制造工艺中需要用酒精作为溶媒,其酒精含量常高达40%~50%,乙醇具有挥发性,引入采用气相色谱法测定其含量。因中药制剂中所有的组分并非全部出峰,故采用内标法定量。通过该实验,学生不仅掌握了气相色谱仪的结构和工作原理,也了解了色谱常用的三种定量方法之一:面积归一法。熟悉了该类仪器的适用范围,并且是对常规,耳熟能详的中药进行测定,学生的学习兴趣和积极性得到提高[7]。
 
  2“色谱-质谱联用技术”在中药学专业本科教学中的实践
 
  由于色谱-质谱联用仪器昂贵,维护及维修费用成本高且公套数少。在本科教学中使用该类仪器,一旦出现损坏则会影响科研进度,所以在高校色谱-质谱联用仪这类高端仪器基本上只用于科研工作中。为了证实“色谱-质谱联用技术”在中药专业实践的可行性,尝试在本科三年级中药专业的学生中开展该类仪器的使用。这部分学生已完成了分析化学、药物分析、波谱解析和中药制剂分析等理论课和基础实验课,了解了基本的分析仪器理论知识,也掌握了相关的实验技能。根据实验设置的目的,结合中药学科研及社会应用情况设置具体实验项目,见表1。
  2.1气相色谱技术(GC)
 
  气相色谱技术(GC)利用物质的沸点和极性不同实现混合物的分离,用于测定中药的挥发油、氨基酸、脂肪酸等分子量小或易挥发物质,成为科研机构药物含量测定、溶剂和农药残留分析、杂质检查等中药质量控制常用技术。本实验中,将“气相色谱法测丙酮的含量”这个实验改为“气相色谱法测定藿香正气水中乙醇含量”,该操作简单,方法快捷。图1所示为利用气相色谱法测藿香正气水中的乙醇,乙醇出峰时间为2.417 min。
  2.2高效液相色谱技术(HPLC)
 
  中药材及其复方制剂中有效成分的含量是衡量其质量的重要指标。高效液相色谱法(HPLC)能够测量挥发性好和热稳定性差的样品,是中药研究的最重要的方法之一。在具体实践中,选用常用中药六味地黄丸为研究对象,六味地黄丸主要成分为熟地黄、山药、山萸肉、丹皮、泽泻、茯苓,具有滋阴补肾的功效,包括汤剂、小蜜丸、大蜜丸、口服液、浓缩丸等多种剂型。六味地黄丸中丹皮酚含量是《中国药典》规定的检测其质量的重要指标。HPLC在这方面应用广泛,能测定黄酮类、生物碱类、皂苷类、醌类、香豆素类及各种成分。因此,结合药典,本实验利用高效液相色谱法测定六味地黄丸中丹皮酚的含量来拓展学生能力。从而保证学生掌握高效液相色谱仪的使用,掌握该类仪器在中药制剂定量分析中的应用[8-10]。图2所示为利用高效液相色谱测到的丹皮酚的色谱峰,出峰时间为3.150 min。
  2.3气相色谱-质谱联用(GC-MS)
 
  气相色谱-质谱联用(GC-MS)方法,发展成熟,目前已经成为中药化学成分研究的重要手段。GC-MS具有高分离效能、强选择性、高灵敏度等优势,在中药挥发性成分的分析和含量、中药中农药和试剂残留测定等领域发挥着重要作用,广泛应用于中药复杂组分的分离与鉴定[11]。本科生实验选取道地药材温郁金作为研究对象,因为温郁金为著名的“浙八味”之一,主产于浙江温州,药用历史悠久。其功能主治以清心解郁、保肝利胆为主。温郁金的主要成分为挥发油,组织学生查找文献,设计方法,借助气相色谱质谱法鉴定温郁金中挥发油的成分(见图3),利用面积归一法计算挥发油的成分,帮助学生掌握该仪器的结构原理和适用范围。
 
  2.4高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)
 
  液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)克服了GC-MS的局限性,具有快速、灵敏度更高、测量范围广、定性和定量能力强等优点,是中药化学成分分析、中药代谢物和代谢组学研究的理想工具,具有广阔的应用前景。姜黄素是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种化学成分,为二酮类化合物。
  姜黄素血药浓度检测方法有UV,HPLC-UV,HPLC-ECD,用于体内分析时步骤多且误差大,学生实践性差,带领学生摸索HPLC-MS测定姜黄素的大鼠血浆中的浓度的方法,通过比较分析,找出步骤简单且灵敏度更高的方法[12-15]。实验采用ACQUITY I-Class UPLC和XEVO TQS-micro三重四极杆质谱仪(Waters Corp,Milford,MA,USA)。Masslynx 4.1软件(Waters Corp.)进行数据采集和仪器控制。色谱柱为UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7μm),柱温设为40℃。流动相由乙腈和0.1%甲酸组成,梯度洗脱,流速为0.4 mL/min。从初始到0.2 min,乙腈保持在10%;经过1.3 min,乙腈从10%升到75%;乙腈在75%保持0.5 min;经过0.5 min,乙腈从75%返回到10%;乙腈在10%平衡1.5 min。总共运行时间为4.0 min。氮气作为去溶剂化气体(800 L/h)和锥形气体(50 L/h)。毛细管电压设为2.2 kV,离子源温度为150℃和去溶剂化温度为400℃。电喷雾离子源(ESI),正离子检测,采用多反应监测(Multiple reaction monitoring)方式进行定量分析,姜黄素m/z 369.202→177.051锥孔电压为32 V,碰撞电压为26 V),图4所示为大鼠血浆中姜黄素超高效液相色谱质谱联用图谱。
 
  3开放大型仪器培养技术型人才
 
  本次实验探索借助浙江省药学实验示范中心的大型仪器共享平台,让色谱质谱联用技术贯穿中药专业本科教学实验,希望为学生毕业以后顺利融入社会打下基础。浙江省药学实验示范中心配备有Waters XEVO TQ-S micro三重四级杆液质联用仪,Agilent 5975B-6890N气相色谱质谱联用,Waters UPLC H-Class系统,Agilent 1260 HPLC(配DAD、电化学检测器、蒸发光散射检测器)等。主要通过以下手段实施:
 
  ①定期举办色谱质谱联用技术理论、实践培训班,由经验丰富的、管理质谱联用仪器的专业人员任教,或者邀请对应的仪器公司工程师举办仪器专题讲座;②编写大型分析仪器使用教材,目前大多数有关大型分析仪器的教材偏重理论和研究,可由有管理质谱联用等大型仪器经验的专业人员编写教材,在编写过程中首先充分考虑学生在实际操作中的困难,以固定型号仪器为样本,尽可能举一反三,在实用性方面,文字表达简练,图文并茂,并有相关仪器使用教程的视频讲解;
 
  ③将色谱质谱联用技术融入本科实验中。考虑到现有大型仪器的情况及课程衔接等因素,实验带教老师对实验讲义做了修改并进行了可行性分析。④浙江省药学实验示范中心的大型仪器共享平台向本科生开放,让优秀的学生融入科学研究中,使学生有更多的机会接触大型仪器,提高实验操作能力。
  4结语
 
  通过色谱-质谱联用技术在中药学专业本科教学中的实践与探索,取得了较好的教学效果,实践表明,色谱-质谱联用可以充分用于本科教学实验,也可以推断大型仪器设备资源充分用于本科教学实验。利用大型仪器作为支撑,将本科教学中的简单验证实验纳入综合性研究性实验,给学生提供了足够的空间思考,讨论和相互学习。本科生利用大型仪器在上课时间内完成各类综合实验,这对提高实验技能,开拓专业视野,培养创新思维有很大帮助。将继续探索和实践大型仪器设备在本科实验教学中的使用,提高实验教学质量,培养更多高水平的技术人才。
 
  参考文献(References):
 
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