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高效液相色谱技术及其在药物分析中的应用

2020-07-09 09:00 出处:未知 人气: 评论(0
  [摘要]高效液相色谱是一高效、快速的分离分析技术,灵敏度高且选择性好。HPLC能直接分析难挥发、大分子、强极性及热稳定性差的化合物,适用于体内药物分析,广泛应用于药物合成的各步反应的监控和临床治疗药物的监测,同时也用于分离天然植物药的有效成分和分析中成药的各种有效成分。
 
  [关键词]HPLC;体内药物分析;天然药物
 
  高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)是在经典液相色谱法的基础上,引入气相色谱法的理论和实践技术,以高压输送流动相,采用高效固定相及高灵敏度检测器,发展而完成的现代液相色谱分析方法[1]。HPLC具有同时分离和分析的功能,对于体内药物分析和体内内源性物质的分析及成分复杂的重要分析尤为重要,色谱分离后排除了干扰,大大提高了分析测定的选择性和准确性。HPLC的分离功能还广泛用于药物的纯化和制备,也适合于一些微量成分和痕量成分(如杂质或代谢产物)的分析。
 
  医药分析包括对药物含量主成分的含量测定,以及对各种可能存在的杂质、分解产物等微量成分的鉴别和分析,及药品质量标准中的定性、定量和杂质检查测定,还包括对药物的开发研究至生产阶段的每个环节进行质量追踪,同时还包括药物代谢产物的分析、鉴定以及临床治疗药物的监测和体内物质的分析、测定。HPLC在西药的分析中应用于质量控制,尤其表现在微量成分和痕量成分的分析。而在中药材鉴定和质量分析上也越来越重要,它的应用将促进我国中药质量的标准化和规范化。
 
  1高效液相色谱法
 
  1.1高效液相色谱的基本分析方法
 
  类型:(1)定性分析:既包括有效成分或主要成分的定性鉴别,也包括杂质的鉴别,在体内药物分析中还包括各种代谢产物的鉴别。(2)定量分析:包括上述各种组分的定量测定。(3)杂质限度实验。
 
  分类:(1)定性分析方法:①色谱鉴别法;②化学鉴别法;
 
  ③光谱鉴别法。(2)定量分析方法:①峰高和峰面积;②外标法;
 
  ③内标法;④内加法。(3)药物杂质总量限度测定法。(4)制备型高效液相色谱法。
 
  1.2液相色谱的优点
 
  (1)不受试样的挥发性和热稳定性的限制,应用范围广。(2)可选用不同性质的各种溶剂作为流动相,而且流动相对分离的选择性有很大作用,因此分离选择性高。(3)一般在室温条件下进行分离,不需要高柱温。
 
  2药物分析中的应用
 
  2.1体内药物分析的特点
 
  被测定的药物和代谢物的浓度极低;样品介质复杂,其中存在各种各样直接或间接影响测定结果的物质,大多需要分离和净化;仅有少量样品可供分析,尤其是在连续测定过程中,很难再度获得完全相同的样品;样品的稳定性需要特别注意。
 
  2.2HPLC在体内药物分析中的应用
 
  2.2.1研究实例1——RP-HPLC荧光检测法同时测定血浆中的盐酸维拉帕米和活性代谢物去甲维拉帕米的浓度[2]。
 
  2.2.1.1色谱行为Ver、Nor及Gal的色谱峰保留时间分别为18.2、16.4和21.8min,分离度Rver-nor≥1.2,Rnor-gal≥1.8,无内源性杂质峰及维拉帕米其他代谢产物干扰。
 
  2.2.1.2标准曲线的制备于空白血浆中加入Ver(3.89μg/mL)、Nor(3.67μg/mL)的标准溶液,使其浓度分别为7.78和7.34;19.45和18.35;38.9和36.7;97.25和91.75;194.5和183.5;291.75和275.25;389和367;486.25和458.75ng/mL,处理,测定。以样品的浓度(X,ng/mL)为横坐标,样品与内标色谱峰高比值(Y)为纵坐标作直线回归计算。结果表明,在5~500ng/mL范围内(n=8)线性良好(Ver的治疗血药浓度不超过500ng/mL)。Ver、Nor在人血浆中回归方程及相关系数分别为:Yver=0.0048+5.324×10-3X,r=0.9997;Yvor=0.0771+5.719×10-3X,r=0.9994。
 
  2.2.1.3最低检测限测定当信噪比(S/N)=3时,Ver和Nor的最低检测限分别为1.9和1.8ng/mL。
 
  2.2.1.4方法回收率各取空白血浆1mL,分别加入Ver、Nor标准液,配成低、中、高浓度(40、200、400ng/mL)的标准血浆各5批,测定,代入标准曲线计算,与加入的实际浓度比较,计算方法回收率。Nor高、中、低浓度的方法回收率分别为(101.9±1.9)%、(100.8±5.3)%、(102.6±8.5)%。Ver低、中、高浓度的方法回收率分别为(111.9±5.7)%、(101.1±3.4)%、(100.3±3.5)%。
 
  2.2.1.5精密度试验准确配制高(400ng/mL)、中(200ng/mL)、低(40ng/mL)3个浓度的血样,同日内处理测定5批,计算日内相对标准偏差;隔日测定1批,连续5批,计算日间相对标准偏差。以高、中、低浓度顺序Ver的日内差RSD为5.13%、3.35%、3.51%,日间差RSD为4.03%、2.91%、1.52%。Nor的日内差RSD为8.29%、5.21%、1.92%,日间差RSD为7.83%、2.60%、3.10%。
 
  2.2.1.6方法学应用8名健康志愿者,晨起标准餐后3h单次口服Vor片(40mg×2),分别于服药后0、0.333、0.667、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0h,前臂静脉取血2mL,分离血浆后处理测定,得出Ver和Nor的药时曲线。
 
  2.2.2研究实例2——RP-HPLC荧光检测法测定人血浆中酒石酸唑吡坦的浓度[3]。
 
  2.2.2.1色谱条件分析柱:HypersilOSD2(中国科学院大连化学物理所,200mm×4.6mm,5μm);流动相为乙腈0.023。
 
  2.2.2.2血样预处理取血浆样品500μL,置10mL离心管中,加入250μL 0.25mol/L KOH,振荡1min,加5mL乙醚,涡旋振荡2min,于10 000r/min离心5min,取醚层4mL,转移至5mL离心管中,于37℃水浴氮气吹干,残渣用250μL甲醇溶解,50μL进样。
 
  2.2.2.3血浆标准曲线及最低检测限取健康人空白血浆共6份,依次加入酒石酸唑吡坦标准液使成5.0、10.0、25.0、50.0、100.0和250.0ng/mL的不同浓度,按前述方法处理后进样,以所测峰面积对浓度进行线性回归。结果表明,酒石酸唑吡坦在5.0~250ng/mL范围内线性良好,回归方程为A=625.5+772.6C,r=0.9995,检测0.25ng(S/N=3),血浆中最低检测浓度为2.5ng/mL。
 
  3天然化学中的应用
 
  3.1天然药物现状
 
  随着中药研究事业的不断发展,中药材在国内和国际的需求量越来越大,国际上对药材的质量要求也越来越高。药物的重要有效成分的含量成为质量检查必不可少的参数,高效液相色谱的使用也越来越广泛。
 
  单味中药:(1)含生物碱的中药:麻黄、黄连、延胡索、防己、吴茱萸等。(2)含黄酮类化合物的中药:黄芩、葛根、银杏叶、红花等。(3)含蒽醌类化合物的中药:大黄、何首乌、决明子。
 
  中成药:蛇胆川贝液、葛根芩连片、黄连上清片、速效牛黄丸、半夏泻心散、木香顺气丸、逍遥丸、丹参注射液等。
 
  3.2反相高效液相色谱法的应用
 
  研究实例3——反相高效液相色谱法同时测定补阳还五汤中芍药苷和阿魏酸的含量[4]。
 
  3.2.1对照品贮备液的制备称取芍药苷4.459mg和阿魏酸0.2192mg,置于10mL棕色容量瓶中,用甲醇稀释定容,摇匀,得浓度为445.9μg/mL芍药苷溶液和21.92μg/mL阿魏酸溶液。
 
  3.2.2供试溶液的制备《医林改错》古方,取黄芪120g,当归6g,赤芍4.5g,地龙、川芎、桃仁、红花各3g,置1000mL烧杯中,加500mL水浸泡30min,武火煎煮沸腾后,文火再煎30min,共煎2次,每次30min,合并提取液。将煎好的补阳还五汤用纯化水稀释10倍,摇匀,1500r/min离心10min,上清液用0.22μm微孔滤膜过滤,取续滤液备用。
 
  3.2.3阴性对照溶液的制备按处方比例配成不含川芎、当归和赤芍的补阳还五汤样品,然后制备阴性对照溶液。
 
  3.2.4线性关系考察精密吸取芍药苷、阿魏酸对照品储备液适量于6个10mL棕色容量瓶中,加甲醇定容,摇匀备用,得到一系列不同浓度的对照品混合溶液。分别取各梯度混合对照品溶液适量,进样20μL。分别以芍药苷、阿魏酸对照品的浓度(X,μg/mL)为横坐标,以其峰面积积分值(Y)为纵坐标绘制标准曲线,结果芍药苷:Y=87.705X-4.934,r=0.9999,线性范围4~24μg/mL;阿魏酸:Y=120.799X+91.816,r=0.9998,线性范围0.4~2.0μg/mL。由此可见,芍药苷和阿魏酸对照品在所选的范围内线性关系良好。
 
  4结论
 
  高效液相色谱法在体内药物分析中具有样品处理简便、快速,标准曲线的线性较好,精密度和灵敏度均能够符合药动学研究和治疗药物监测的需要的优点。而且,HPLC能同时进行分离和定量测定,这在治疗药物监测和药代动力学中应用极为广泛[5]。
 
  近年来,HPLC在仪器、检测器、固定相等方面都有很大的发展,这大大促进了在中、西药的药物分析应用。但每一种分析技术均有其使用范围和方法的局限性,因此色谱技术联用变得越来越普遍。现在主要是色谱-色谱联用、色谱-光谱联用、高效液相色谱-质谱联用,还有柱切换技术以及高效液相色谱-傅立叶变换红外吸收光谱联用等。高效液相色谱与其他技术的联用是高效液相色谱今后的主要发展方向。
 
  [参考文献]
 
  [1]李发美.医药高效液相色谱技术[M].北京:人民卫生出版社,1999:110-150.
 
  [2]邹豪,蒋雪涛,马伯良,等.RP-HPLC荧光检测法同时测定血浆中的盐酸维拉帕米和活性代谢物去甲维拉帕米的浓度[J].中国药学杂志,2001,36(8):537-539.
 
  [3]宋洪杰,李珍,石晶,等.高效液相色谱-荧光检测法测定人血浆中酒石酸唑吡坦的浓度[J].中国药学杂志,2001,36(5):333-335.
 
  [4]朱伟,王学美.反相高效液相色谱法同时测定补阳还五汤中芍药苷和阿魏酸的含量[J].医药导报,2006,25(1):60-62.
 
  [5]吕娟涛,杨伟丽,潘秋燕.高效液相色谱法在药学研究中的应用与进展[J].实验与学习,2005,23(22):91-92.

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