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测定大鼠血浆中士的宁和马钱子碱含量的方法研究

2020-07-03 08:34 出处:未知 人气: 评论(0
  摘要:目的:探讨可以同时测定大鼠血浆中士的宁和马钱子碱含量的方法研究。方法:Wistar大鼠血浆样品经液液萃取处理后用Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱分离,流动相为乙腈-酸水(17?83),酸水为0.02 mol·L-1磷酸二氢钾与0.014 8 mol·L-1庚烷磺酸钠等量混合,并用10%磷酸调体系pH为2.8;检测波长为260 nm。结果:Wistar大鼠血浆中杂质不干扰样品的含量测定,士的宁含量在0.067 84-3.392 00μg·mL-1,马钱子碱含量在0.052 48-2.624 00μg·mL-1,线性良好,日内、日间精密度均小于10%,平均回收率均大于85%,稳定性符合体内药物分析要求。结论:UPLC检测法灵敏度高、精密度好,可应用于通脉丸中士的宁与马钱子碱药物动力学研究。
 
  关键词:士的宁马钱子碱超高效液相色谱法体内药物分析
 
  通脉丸是全国周围血管专业主任委员崔公让教授的经典处方,由制附子、黄芪、两头尖、制马钱子、丹参等多味中药组成,具有祛风湿、通经络、消肿痛之功效,现为河南中医学院第一附属医院院内制剂,用于治疗血栓闭塞性脉管炎、动脉硬化闭塞症、风寒湿痹、四肢惊孪等肢体缺血性疾病,临床疗效显著[1]。毒性药材往往是影响临床用药安全的关键,因此研究分析通脉丸中的毒性药材如马钱子的有效成分很有必要,也为通脉丸新制剂的研发奠定基础。
 
  马钱子又名番木鳖,始载于《本草纲目·卷十八》,是马钱科植物马钱Strychnos nux-vomica Linn的干燥成熟种子。生物碱为其主要有效成分,其中又以士的宁(strychnine)和马钱子碱(brucine)含量最高,士的宁占总生物碱的35%-50%,其次为马钱子碱[2,3]。马钱子碱是其镇痛的主要成分,具有很强的镇痛、抗炎、抗肿瘤等药理作用[4-6]。士的宁临床药理作用较弱,是马钱子的主要毒性成分,炮制后毒性会明显下降[7,8]。目前的研究显示,小鼠灌服给药,士的宁的LD50是马钱子碱的71.25倍,对中枢神经系统和免疫系统及肾脏有毒性作用[9]。目前,已经建立了不同配伍关系中有毒成分或有效成分的化学库,确定了马钱子配伍常用药对洋金花的毒效反应物质基础[10]。本研究建立了UPLC测定士的宁和马钱子碱血药浓度的分析方法,研究马钱子碱和士的宁在大鼠体内的药动学[11-15]。
 
  1材料
 
  1.1实验动物
 
  SPF级Wistar大鼠,280-320 g,雄性,由山东济宁鲁抗动物实验中心提供,许可证号:SCXK鲁20130001。饲养环境:室温恒定25℃,湿度为50%,通风状况良好。饲养工作程序:每周两次加水加料、更换垫料、整理卫生、饲养室消毒、垫料笼具等高压灭菌。
 
  1.2实验仪器和试剂
 
  H-Class超高效液相色谱仪(美国Waters公司);元素型18120纯水装置(上海摩勒科学仪器有限公司);KQ-100DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Neofuge1600R台式低温高速离心机(上海力申科学仪器有限公司);PHS-3C数字式酸度计(上海雷磁仪器厂);GP225D赛多利斯电子天平(十万分之一天平,德国Sartorius公司);BSA2245-CW型电子天平(万分之一天平,德国Sartorius公司);GM-1.0A隔膜式真空泵(天津市津腾实验设备有限公司);BT-Ⅱ水浴式氮吹仪(北京八方世纪科技有限公司);IKA-天才3涡旋混匀仪(德国IKA公司);磷酸二氢钾(天津永大,批号:20100110);庚烷磺酸钠(山东禹王,批号:2012091103)。
  2实验方法
 
  2.1血浆样品处理方法
 
  取大鼠全血0.5 mL,15 000 r·min-1离心8 min,精密吸取上层血浆200μL,加入氨水100μL,涡旋混合30 s,后再加入甲基叔丁基醚1.2 mL,涡旋1 min,15 000 r·min-1离心15 min后吸取上层甲基叔丁基醚液,剩余物再次加入甲基叔丁基醚1.2 mL重复以上操作,合并两次萃取液后于40℃氮气流吹干。残渣加入甲醇溶解,涡旋1 min后于15 000 r·min-1离心20 min,取上清液测定。
 
  2.2色谱条件
 
  Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1×100 mm,1.7μm);流动相:乙腈-磷酸水(17?83);酸水:0.020 0 mol·L-1磷酸二氢钾与0.014 8 mol·L-1庚烷磺酸钠等量混合,并用10%磷酸调体系至pH2.8;流速0.3 mL·min-1;检测波长260 nm;柱温30℃;进样量2μL。
 
  2.3士的宁与马钱子碱对照品溶液的配制
 
  精密称取士的宁对照品4.24 mg,加甲醇定容至50 mL量瓶中,得到84.8μg·mL-1士的宁对照品溶液,用甲醇稀释至不同的倍数,得到浓度分别为0.068、0.102、0.169、0.424、0.848、1.696、3.392μg·mL-1,7个不同浓度的士的宁对照品溶液。
 
  精密称取马钱子碱对照品3.28 mg,加甲醇定容至50 mL量瓶中,得到65.5μg·mL-1马钱子碱对照品溶液,用甲醇稀释至不同的倍数,得到浓度分别为0.052、0.079、0.131、0.328、0.656、1.312、2.624μg·mL-1,7个不同浓度的马钱子碱对照品溶液。
 
  3实验结果
 
  3.1方法学考察
 
  3.1.1专属性考察
 
  采用上述血浆样品处理方法和UPLC色谱条件,进样测定大鼠空白血浆、空白血浆加士的宁、空白血浆加马钱子碱和大鼠灌胃样品后所得到的血浆色谱图,见图1-图4。结果表明血浆中内源性物质不干扰两成分的测定。马钱子碱和士的宁的保留时间分别为5.2 min与6.0 min。
 
  3.1.2线性关系考察
 
  取大鼠空白血浆200μL,分别加入0.068、0.10176、0.424、0.848、1.696、3.392μg·mL-1士的宁对照品溶液100μL,按照2.1项方法处理;另取大鼠空白血浆200μL,分别加入0.052 48、0.078 72、0.328、0.656、1.312、2.624μg·mL-1马钱子碱对照品溶液100μL,处理方法同上。分别吸取上述不同浓度血浆样品溶液2μL进样测定,记录峰面积,以血药浓度(C)为横坐标,以峰面积Y(A)为纵坐标,分别得到士的宁标准曲线方程为:Y=12 233 668.709 6X+174.512 3(R2=0.999 8);马钱子碱标准曲线方程为:Y=11 927 585.371 1X-464.507 6(R2=0.999 7)。士的宁在进样量0.000 135 7-0.006 784 0μg范围内,与峰面积线性关系良好,马钱子碱在进样量0.000 104 9-0.005 248 0μg范围内,与峰面积线性关系良好。
 
  3.1.3精密度试验
 
  按照标准曲线制备方法,取大鼠空白血浆200μL,分别加入高、中、低(3.392、0.848、0.169μg·mL-1)浓度的士的宁对照品溶液100μL,按“2.1”项方法处理,得到高、中、低血浆质控样品;另取大鼠空白血浆200μL,分别加入高、中、低(2.624、0.656、0.131μg·mL-1)浓度的马钱子碱对照品溶液100μL,以同士的宁方法处理,得到马钱子碱高、中、低血浆质控样品。分别平行处理5份,进样测定,计算日内及日间精密度,结果见表1-表6。


  3.1.4回收率试验
 
  提取回收率考察:取大鼠血浆200μL作为空白对照,分别加入高、中、低(3.392、0.848、0.169g·mL-1)浓度的士的宁对照品溶液100μL,按照2.1项方法处理得到高、中、低血浆质控样品;另取大鼠空白血浆200μL,分别加入高、中、低(2.624、0.656、0.131μg·mL-1)浓度的马钱子碱对照品溶液100μL,得到马钱子碱高、中、低浓度血浆质控样品。分别进样测定,重复5次,记录所得峰面积(A测)。另外用纯品溶剂溶解并稀释使其浓度与前者处理后浓度一致,进样测定并记录所得峰面积(A真)。提取回收率/%=A测/A真×100%。结果见表7-表9,加入高、中、低3个浓度的士的宁提取回收率分别为87.1%、84.4%、87.9%,RSD值均小于10%,加入高、中、低三浓度的马钱子碱提取回收率分别是86.1%、87.4%、89.2%,RSD值均小于10%,符合生物样品分析方法的指导原则的要求。

  3.1.5稳定性考察
 
  室温稳定性考察:取大鼠空白血浆200μL分别在室温下放置0、4、8、12、24 h后,分别加入高、中、低(3.392、0.848、0.169μg·mL-1)浓度的士的宁对照品溶液100μL,按照血浆样品处理方法处理后,取上清液,得到高、中、低血浆质控样品;另取大鼠空白血浆200μL,分别加入高中低(2.624、0.656、0.131μg·mL-1)浓度的马钱子碱对照品溶液100μL,以同士的宁方法处理,得到马钱子碱高、中、低浓度血浆质控样品,分别进样测定,记录峰面积结果见表,RSD值均小于10%,质控样品在室温下24 h内稳定性良好(表10-表12)。
 
  冻融稳定性考察:取大鼠空白血浆200μL,分别加入高、中、低(3.392、0.848、0.169μg·mL-1)浓度的士的宁对照品溶液100μL,另取大鼠空白血浆200μL,分别加入高、中、低(2.624、0.656、0.131μg·mL-1)浓度的马钱子碱对照品溶液100μL,士的宁与马钱子碱3个浓度各平行做3份,置于-78℃冰箱中放置24 h,取出在室温下自然融解,完全融化后再次放入置于-78℃冰箱中,此过程重复3次。取出后加入氨水100μL,涡旋混合30 s,再加入甲基叔丁基醚1.2 mL,涡旋1 min,15 000 r·min-1离心15 min,吸取上层甲基叔丁基醚液存于另一离心
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