内容字号:默认大号超大号

段落设置:段首缩进取消段首缩进

字体设置:切换到微软雅黑切换到宋体

肌苷分子印迹聚合物的合成及其吸附性能研究

2020-06-28 09:43 出处:未知 人气: 评论(0
  摘要目的:合成肌苷分子印迹聚合物并研究其吸附性能。方法:以肌苷为模板分子,丙烯酰胺为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,合成了肌苷印迹聚合物(INO-MIP)。采用静态平衡吸附实验评价肌苷对底物分子的结合特性,并进行了吸附动力学研究和选择性实验。结果:INO-MIP对肌苷和次黄嘌呤呈现出了较高的选择吸附特性;Scatchard分析显示INO-MIP对肌苷存在两类结合位点,高亲和力结合位点的离解常数Kd=0.1757 mL·g-1,最大结合量Qmax=4.302μmol·g-1,低亲和力结合位点的离解常数Kd=1.6946 mL·g-1,最大结合量Qmax=22.957μmol·g-1。结论:合成的印迹聚合物对肌苷、次黄嘌呤具有较高的亲和力和特定的选择性,可望将其应用于肌苷和次黄嘌呤的体内药物分析中。
 
  关键词:分子印迹聚合物;肌苷;次黄嘌呤核苷;合成;吸附;Scatchard分析;体内药物分析
 
  肌苷(inosine)又名次黄嘌呤核苷,分子结构式如图1,是一种生物发酵产品,在临床上用于治疗心脏病、肝病、白血球和血小板减少症、视神经萎缩、中心性视网膜炎,能预防及解除由血防药物引起的对心脏或肝脏副作用[1]。肌苷是核酸分解代谢的中间产物,量化关系直接反应核酸代谢水平,其参与体内能量的合成,增加白细胞的生成,提高机体免疫力。在缺血、缺氧、血管内凝血等疾病过程中肌苷对其发生和发展均起着重要的作用[2]。因此,建立体内肌苷的含量测定方法在临床上具有重要的意义。目前,对肌苷的测定方法主要有高效液相色谱法[3]、毛细管电泳[4]、酶电极法[5]、紫外分光光度法[6]等。然而这些方法在分析生物样品时,常需对样品进行前处理,常用方法有萃取法、水解法等,需要消耗大量的时间和成本。而传统的固相萃取是非特异性的萃取,对于背景复杂的生物样品萃取效率低、步骤烦琐。萃取后最常见的测定体内肌苷的方法为高效液相色谱法,而色谱条件往往采用梯度洗脱[7]或加入缓冲盐[2,8],过程复杂。对于体内肌苷而言,由于含量较低以及背景复杂,在进行检测之前有必要对其进行分离富集,以提高检测的灵敏度和准确度,从而实现人体内低含量肌苷的有效检测。因此,研发一种肌苷的富集分离方法,并使用简单的高效液相色谱条件对其痕量的检测具有重要的意义。
  分子印迹技术是近年来迅速发展起来的一种制备对特定目标分子具有高结合力的聚合物(即分子印迹聚合物Molecular imprinted polymers,MIPs)的过程。MIPs除具有构效与定性、特异识别性和广泛实用性三大特点外,还具有可重复使用次数多,稳定性好等优势,已经在对映体和异构体的分离、固相萃取、化学仿生传感器、模拟酶催化、临床药物分析、膜分离技术和药物开发等领域显示出广泛的应用前景[9-11]。本研究采用本体热聚合方法成功制备了肌苷印迹聚合物(inosine-molecular imprinted poly-mers,INO-MIP),并研究了其吸附性能。
 
  1实验部分
 
  1.1试剂肌苷(含量98%)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA,10%的氢氧化钠除去阻聚剂,含量98%)、偶氮二异丁腈(AIBN,含量99%)、胞嘧啶核苷(含量99%)、次黄嘌呤(含量99%),上述5种试剂均购自阿拉丁化学试剂有限公司;尿苷(含量98%,北京上立方联合化工技术研究院);丙烯酰胺(AM,含量98%,百灵威科技有限公司);N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇(色谱纯)、冰醋酸,均购自国药集团化学试剂有限公司;除特殊说明外,其他试剂均为分析纯,所有实验用水为二次蒸馏水。
 
  1.2仪器Agilent 1260自动进样高效液相色谱仪
 
  以及安捷伦化学工作站(美国安捷伦科技有限公司);
 
  Agilent TC-C18色谱柱(5μm,4.6 mm×250 mm)(美国安捷伦科技有限公司);UV-2450紫外可见分光光谱仪(日本岛津公司);HH-2数显恒温水浴锅(国华电器有限公司);SHA-B恒温振荡器(江苏金坛市岸头中旺实验仪器厂);DZF-6050真空干燥箱(上海博讯实业有限公司);KQ-250DE(数控超声波清洗器);SZ-97自动三重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂);BS 124S分析天平(上海奕宇电子科技有限公司)。
 
  1.3模板分子肌苷与功能单体AM比值的优化
 
  应用紫外-可见吸收光谱法,研究模板分子肌苷与功能单体丙烯酰胺(AM)在DMF溶剂中的相互作用,固定肌苷的浓度为0.02μmol·mL-1,渐增AM的浓度,AM的浓度分别为0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20μmol·mL-1,即模板与AM的比值分别为1∶1,1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10,超声振荡混匀5 min后静置2 h使充分作用,以DMF为参比溶液,经紫外-可见分光光谱仪扫描,得到相应溶液的紫外吸收光谱。
 
  1.4肌苷分子印迹聚合物(INO-MIP)合成将0.0547 g(0.2 mmol)的肌苷溶于5 mL DMF中,加入功能单体AM 0.0879 g(1.2 mmol)超声(250 W,40 kHz)振荡混匀5 min,加入乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)1.151 mL(6 mmol)作为交联剂,将混合液倒入10 mL安剖瓶中,再加入10 mg引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)。超声振荡脱气5 min,通氮气5 min,封管,放入60℃恒温水浴锅中加热24 h,得到块状聚合物固体,经研磨粉碎过200目筛。用10%乙酸甲醇索氏提取,提取液用高效液相色谱法检测,抽提至提取液在248 nm处检测无模板分子对应的色谱峰出现,再用蒸馏水多次洗涤残留的乙酸和甲醇,得到的粒状聚合物置真空干燥箱中干燥至恒重。非印迹聚合物(non-imprinted polymers,NIP)的合成方法与INO-MIP完全一致,只是合成时不加入肌苷(模板分子)。
 
  1.5分子印迹聚合物吸附性能和分子识别特性
 
  1.5.1色谱条件[12]用HPLC法考察INO-MIP吸附性能。流动相:甲醇-水(10∶90),使用前用0.45μm微孔滤膜过滤,并超声20 min除去溶剂氧;检测波长:248 nm;流速:1.0 mL·min-1;进样量:20μL;柱温30℃。
 
  1.5.2肌苷聚合物(INO-MIP)吸附动力学曲线的测定
 
  称取10 mg已制备好的INO-MIP 9份,分别置于10 mL量瓶中,各加入0.6μmol·mL-1肌苷水溶液5 mL,于28℃下水浴恒温振荡15 min、30 min、60 min、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h后,3000 r·min-1离心10 min,微孔滤膜过滤后,用HPLC分别测定上清液中肌苷水溶液的浓度,平行测定3次,取平均值,利用差减法计算吸附量Q随时间(t)的变化值。计算公式如下[13]:
 
  Q=(C0-C)V/m(1)
 
  其中,Q表示聚合物的吸附量(μmol·g-1);C和C分别为肌苷溶液吸附前的浓度和吸附饱和后肌苷的浓度(μmol·mL-1);V为吸附体积;m表示聚合物的质量(mg)。
 
  1.5.3静态平衡吸附试验(等温吸附性能)称取10 mg已制备好的INO-MIP或NIP 9份,分别置于10 mL容量瓶,各加入0.06、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2μmol·mL-1的肌苷水溶液5 mL,放入28℃恒温振荡器中振荡12 h后,取出,3000 r·min-1离心10 min,微孔滤膜过滤后,用HPLC分别测定上层清液中肌苷水溶液的浓度,平行测定3次,取平均值,计算吸附量Q(μmol·g-1),计算公式同(1-1)。在相同条件下比较NIP对肌苷水溶液的吸附性能。
 
  1.5.4选择性试验
 
  本实验选择与肌苷分子结构相似的几种核苷类化合物尿苷、胞嘧啶核苷和次黄嘌呤为底物(干扰物)进行比较,考察INO-MIP和NIP对底物的选择性吸附能力与分子识别性能。各底物分子结构如图2。
  对比分别与肌苷混合后在聚合物上的吸附情况,计算不同底物在INO-MIP和NIP上的吸附量Q,采用静态分配系数KD、分离因子α和相对分离因子α'来表征聚合物对底物的选择性吸附能力。
 
  K、α和α'的计算公式如下[14]:
 
  KD=Q/CS(2)
 
  α=KDi/KDj(3)
 
  α'=α(MIP)/α(NIP)(4)
 
  其中,Q表示单位质量聚合物对底物(μmol·g-1)的吸附量,C表示吸附平衡时溶液中底物的浓度(μmol·mL-1)。i和j分别表示底物及对照物,当KDi=KDj时,α=1。KD越高,表示聚合物对该底物的结合量越大;α值越高,表示聚合物对底物的选择性越好;α'越高,说明印迹聚合物的选择性比空白聚合物越好。
 
  取20 mg INO-MIP 3份,分别加入0.2μmol·mL-1的肌苷和尿苷的混合水溶液5 mL,0.2μmol·mL-1的肌苷和胞嘧啶核苷的混合水溶液5 mL,0.2μmol·mL-1肌苷与次黄嘌呤的混合水溶液5 mL,28℃恒温振荡器中振荡12 h后,3000 r·min-1离心10 min,微孔滤膜过滤后,用HPLC分别测定上清液中肌苷和干扰物的浓度,平行测定3次,取平均值,计算吸附量Q(μmol·g-1)、K、α和α',计算公式同(1~4)。在相同条件下比较NIP对上述溶液的吸附性能。
 
  2结果与讨论
 
  2.1功能单体用量的优化结果如图3所示,随着功能单体浓度的增加到1∶6时,吸收光谱最大波长出现红移,并且吸收峰强度增加。在π->π*跃迁中,由于激发态极性较基态强,当有功能单体存在时,与功能单体生成较强的氢键,能量降低,因而导致了最大吸收波长红移[15]。这说明在DMF溶剂中AM与模板分子之间有作用。但是加入的功能单体的比例到1∶8和1∶10时,紫外吸收峰的强度反而下降,由此说明,适当的增加功能单体的用量可以使模板与功能单体的作用更充分,但不是功能单体越多越好,因为一方面过量的功能单体可能导致非选择的结合位点的增加,另一方面,功能单体浓度过大可能导致自身的缔合,引起印迹位点降低、吸附传质阻力增加。因此,本研究选择肌苷与功能单体的摩尔比为1∶6来制备INO-MIP。
  2.2 INO-MIP的选择性评价
 
  2.2.1肌苷标准曲线的绘制为研究INO-MIP及NIP的吸附性能,首先绘制了肌苷的标准曲线,分别配制0.04、0.06、0.08、0.10、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2μmol·mL-1的肌苷水溶液,采用HPLC法测定各浓度所对应的峰面积,平行测定3次,取平均值,然后以峰面积A对浓度C(μmol·mL-1)作图,得到标准曲线的线性方程为:
 
  A=1.421×104 C-3.258 r=0.9999
 
  2.2.2肌苷聚合物(INO-MIP)的吸附动力学特性肌苷聚合物的吸附量根据公式(1)计算,得INO-MIP吸附动力学曲线。图4为INO-MIP对0.6μmol·mL-1肌苷水溶液的吸附动力学曲线。由图可知,在2 h前,INO-MIP的吸附量随时间的增大迅速增大,表明在此阶段的吸附速度很快,但是在2 h后,吸附速度明显减慢,12 h后,吸附量随时间的增加基本不再改变,表明吸附动力学趋于平衡,吸附容量达到饱和不再增加。从图中也可以发现动力学曲线的斜率随时间的增加逐渐变小,这是因为肌苷与INO-MIP的印迹孔穴之间的结合逐渐增加,最终使得INO-MIP的记忆效果达到饱和,从而呈现出来的一种吸附平衡状态。
  2.2.3等温吸附性能评价
 
  为研究印迹聚合物和非印迹聚合物的等温吸附性能,采用静态吸附法,分别测定了INO-MIP和NIP对0.06~1.2μmol·mL-1不同浓度的肌苷水溶液的吸附量,由此得出相应的吸附等温线,结果如图5所示,图中5-A为INO-MIP对不同浓度的肌苷的吸附等温线,图5-B为NIP对不同浓度的肌苷的吸附等温线。从图5可以看出,对于相同浓度的肌苷水溶液无论是在高浓度区域还是在低浓度区域,INO-MIP的吸附量均大于NIP的吸附量,在初始浓度低于0.2μmol·mL-1时,INO-MIP和NIP的吸附量差距开始增大,随着模板分子浓度的增加,INO-MIP对肌苷水溶液的吸附量明显高于NIP对肌苷水溶液的吸附量,这表明组成INO-MIP和NIP的空间结构存在明显差异,NIP其表面大量的极性基团,对肌苷的吸附主要是非特异吸附,吸附能力较弱;而INO-MIP包含固定排列的功能基团的空穴,其大小与肌苷互补,这种空穴对肌苷分子具有“记忆”,因而选择性高,吸附能力强。
  在分子印迹的研究当中,常常使用Scatchard模型评价印迹聚合物的结合特性和理论结合位点数,将INO-MIP的等温吸附实验所得的数据分别用Scatchard分析,Scatchard方程如下[16]:
 
  Q/C=(Qmax-Q)/Kd(5)
 
  其中,K(mL·g-1)是结合位点的平衡离解常数,Qmax
 
  (μmol·g-1)代表结合位点的最大表观结合
 
  量,C(μmol·mL-1)表示吸附平衡时溶液中底物的浓度。以Q/C对Q作图,如图6所示。
  从图6中可以看出,在整个试验的浓度范围内,Q/C与Q并不呈现直线关系,但在高浓度和低浓度范围内分别呈现不同的线性关系,说明在INO-MIP中对肌苷存在2种不同结合位点的吸附作用:高亲和力结合位点和低亲和力结合位点。其原因在于功能单体与模板分子存在多种相互作用,可以形成多种作用力形式的功能单体-模板分子复合物,在聚合反应结束除去模板分子后形成了不同的印迹空穴。由Scatchard曲线的斜率和截距可求得的INO-MIP对肌苷的结合参数,结果如下:高亲和力的线性方程为Q/C=-5.693Q+24.492(相关系数r2=0.9785),平衡离解常数K为0.1757 mL·g-1,最大表观结合量Qmax为4.302μmol·g-1;低亲和力的线性方程为Q/C=-0.5901Q+13.547(相关系数r2=0.9108)平衡离解常数K为1.6946 mL·g-1,最大表观结合量Qmax为22.957μmol·g-1
 
  2.2.4 INO-MIP选择性识别为研究选择性试验,需要绘制干扰物在浓度为0.06~0.8μmol·mL-1的范围内,峰面积A对C(μmol·mL-1)的标准曲线,以便于求得各干扰物吸附后的浓度。其线性方程及相关系数r如下:尿苷:A=7908.6C+27.075(r=0.9999);胞嘧啶核苷:A=7772.2C+29.688(r=0.9999);次黄嘌呤:A=11675C+38.588(r=0.9998)。
 
  由静态平衡吸附试验可知,溶液初始浓度为0.2μmol·mL-1时,INO-MIP和NIP才开始有较明显的差别,因此本实验选择底物初始浓度为0.2μmol·mL-1的条件下,用等温吸附法分别测定INO-MIP和NIP对水溶液中各种底物的吸附量,计算聚合物对不同底物的静态吸附量Q、对底物的结合分配系数KD、分离因子α和相对分离因子α',比较INO-MIP对各种底物的选择性。
 
  由表1可见:单独吸附时,MIP对肌苷、尿苷、胞苷和次黄嘌呤的结合量高于NIP对其的结合量,这表明MIP对肌苷及其类似物有一定的印迹效应。且MIP对肌苷和次黄嘌呤的分配系数KD均大于其他底物。在选择竞争吸附实验中,肌苷与其他底物的分离因子α均大于1。这表明INO-MIP能够较好的分离肌苷和其他底物,α值越高,表示聚合物对底物的分离效果越好;可以看出INO-MIP对混合底物分离最好的是胞苷,其次是尿苷,再次是次黄嘌呤,这主要与三者的空间结构有关,胞苷结构与肌苷相差最大,最好分离,而尿苷、次黄嘌呤与肌苷有相似的聚合物作用点—酰胺,且肌苷的苷元为次黄嘌呤(见图2),制备分子印迹聚合物作用点也在次黄嘌呤结构上。因此本实验制备的INO-MIP可以同时对肌苷和次黄嘌呤具有高选择性。而相对分离因子α'表明了INO-MIP比NIP对肌苷与竞争底物的相对分离能力更强。综合分析以上INO-MIP与NIP的各项参数,说明INO-MIP和NIP在空间结构上存在差异,印迹聚合物对肌苷和次黄嘌呤具有较好的吸附性和选择性。
  3结论
 
  本文以肌苷为模板分子,丙烯酰胺(AM)为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂,首次合成了肌苷印迹聚合物(INO-MIP)。通过Scatchard分析研究肌苷分子印迹聚合物的分子识别与结合特性,分子印迹结果表明聚合物对模板分子的识别中,主要有2种结合力起作用。应用该方法合成的印迹聚合物物对肌苷和次黄嘌呤具有很强的亲和力和特定的选择性,可望将其应用于肌苷和次黄嘌呤的体内药物分析中。
分享给小伙伴们:
本文标签:

相关文章

评论

发表评论愿您的每句评论,都能给大家的生活添色彩,带来共鸣,带来思索,带来快乐。

签名: 验证码: 点击我更换图片

评论列表

    Copyright © 2020 医药论文投稿_药学论文网 版权所有