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抗肿瘤药物甲氨蝶呤在体内分析方法进展

2020-06-28 09:22 出处:未知 人气: 评论(0
  关键词甲氨蝶呤抗肿瘤药综述
 
  甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)是抗肿瘤药的一种,它是叶酸拮抗剂,与二氢叶酸还原酶的催化部位结合,阻止该酶将二氢叶酸还原为四氢叶酸,由于细胞内缺乏四氢叶酸辅酶,一碳单位转移过程就受到抑制。首先是脱氧尿苷酸不能变为合成DNA所必需的脱氧胸苷酸,同时嘌呤核苷酸合成早期阶段也受抑制,DNA及RNA合成均可受阻,从而使细胞生长受抑制。甲氨蝶呤用于急性白血病、绒毛膜上皮细胞癌、恶性葡萄胎及牛皮癣症。大剂量给药对骨肉瘤、软组织肉瘤、肺癌、乳腺癌及卵巢癌等有效。某些实体瘤如头颈部癌、肝癌、消化道癌等均有效。
 
  1理化性质
 
  甲氨蝶呤,化学名为:N-[4-[[(2,4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸。化学结构如下图所示:
  甲氨蝶呤为桔黄色粉末,易溶于稀碱、酸和碱金属的碳酸盐溶液,微溶于稀盐酸,几乎不溶于水、氯仿、醇、乙醚。
 
  2体内过程
 
  2.1吸收MTX可以口服、静脉注射、肌肉注射和脑室内注射。口服后在胃肠道迅速吸收,空腹尤甚,其吸收量取决于透过肠道的速度,但有剂量依赖性。小剂量(30mg/m2以下)吸收迅速而完全,1~2小时血药浓度达到高峰。剂量超过80mg/m2,吸收则缓慢而不完全[2]。肌肉注射吸收良好,在30分钟时血药浓度达最高峰。MTX是水溶性酸性药物,不易透过血脑及血CSF屏障自血液进入脑组织和CSF中。采用右侧脑室注射给药,加之CSF内缺乏药物代谢酶系,导致CSF药物浓度高,维持久。
 
  2.2分布经全身给药,MTX分布于全身体液中,浓集于肝,肝中浓度为血浆的1~8倍,血浆蛋白结合率为50~70,脑内难以达到有效药物浓度[5]。采用脑室内给药,CSF中MTX浓度远比血药浓度高(为血药的80~900倍),进入血中的少量药物迅速遍布全身,血药维持在很低水平[4]。采用大剂量MTX的给药方法,由于细胞外药物浓度很高,MTX可不依赖细胞膜的转运机制,直接通过扩散作用向细胞内透入,使细胞内药物浓度达到高水平,MTX的抗瘤作用获得充分发挥,取得常规低剂量治疗时得不到的显著疗效[6]。
 
  2.3代谢MTX在体内至少存在3种代谢产物,7-羟基甲氨蝶呤(7-OH-MTX),2,4-二氨基-7-N-10-甲基叶酸(DAMPA)和MTX的聚谷氨酸衍生物。其中以7-羟基甲氨蝶呤为主要代谢产物。
 
  2.4排泄MTX主要经肾脏排泄[7],服用MTX24小时后,80药物以原形由尿排出体外。动物实验[8]与临床观察[9]均表明:即使肾功能降低不明显,MTX消除半衰期明显延长,毒副作用业已产生。
 
  3药代动力学性质
 
  脑脊液中MTX呈二室开放动力学特点,主要动力学参数为:t1/2α=3h;t 1/2β=48.2h;Vc=15.6mL;AUC=6365mg·h/L;CL=0.324mL/h。白天用药比夜间用药达峰时间快,血中有效浓度高,且血中有效浓度的保留时间亦长。因此采用中剂量MTX,上午8:00~12:00给药,可以最大限度地发挥药物疗效,降低不良反应的发生率[10]。
 
  4有效血药浓度范围
 
  一般认为血药浓度在3×10-7~3×10-6mo1/L可抑制骨肉瘤原发灶的细胞生长,在1.5×10-7~4×10-7mo1/L可抑制骨肉瘤转移灶的细胞生长,主张血药浓度24小时应小于5×10-5mo1/L,48小时应小于5×10-7mo1/L,72小时应小于5×10-8mo1/L,中毒阈值浓度采用5×-8/L。
 
  5体内药物测定方法
 
  5.1磷光测定法检测黄如衡[4]等用磷光测定法检测甲氨喋呤。①样品处理:分别取含MTX的CSF或血液0.1mL,加0.9mL4三氯醋酸(trichloroacetic acid)液,混匀,9000×g离心10分钟,上清液待测。②光化学处理:取0.1mL三氯醋酸上清液加入荧光比色杯中,于紫外分析仪紫外灯照射20分钟后,加0.1mL25乙醇溶液测荧光。λex=340nm,λem=450nm。
 
  高效液相色谱法(HPLC)高效液相色谱法所需样品量少,灵敏度高,操作简便、迅速,广泛应用于甲氨蝶呤的体内药物分析。Lobo[11]等用高度灵敏的HPLC,分析老鼠血浆中在抗甲氨蝶呤抗体存在与缺乏的情况下游离与结合的甲氨喋呤浓度。McCrud-den等用改进的HPLC分析血浆中甲氨蝶呤和其代谢物7-羟基甲氨蝶呤。Sparreboom[13]等用HPLC对人血浆中的甲氨蝶呤与7-羟基甲氨蝶呤进行了定量测定。Emara[14]等用在上柱前氧化分解柱后荧光检测的HPLC测定血浆中的甲氨蝶呤。现举两具体例子如下:
 
  张华年[15]等用固相萃取高效液相色谱法检测生样本中甲氨蝶呤。①样品处理:取Sep柱(C18,5mL×500mg)先用甲醇5mL和水4mL过柱,继以血清0.5mL或脑脊液0mL上样,再以0.9氯化钠注射液淋洗,于2000r/min离心2min,然后用甲醇2mL洗脱,收集内洗脱液,于60℃氮气吹干,用50甲醇100μL重新溶解测定。②检测仪器:HP1100系列高效液相色谱仪,色谱柱为ODS Hypersil(5μL,250mm×4.6mm),流动相为甲醇-乙睛-7磷酸二氢钠和1枸橼酸缓冲液(2:7:91),流速0.8mL/min,柱温:25℃,检测波长:313nm,进样量:20μL。结果按3倍噪音计算,血清和脑脊液中MTX的最低检测浓度分别为10ng/mL和5ng/mL。本方法使MTX与代谢产物及血清中内源性杂质达到基线分离,重现性好,又简便、快速、灵敏度高、特异性强。
 
  李苏[16]等对体内的甲氨蝶呤进行血药浓度监测。取静脉血0.5mL,加入1mo1/L HC1 O 41mL溶液(沉淀蛋白),振摇10min,于2000r/min离心10min。将上清夜倒入装有2g(NH4)SO 4玻璃试管中,加入3mL乙酸乙酯-乙丙醇(10:1)混合液,振摇10min,于2000r/min离心10min。吸取有机层入另一试管中,水层再用3mL混合溶剂重复提取1次,合并有机层,在空气流下吹干。残余物用400μL流动相溶解,2000r/min离心过滤,取50μL直接进样。本法所需样品量少,灵敏度高,简便,迅速。
 
  5.3放射免疫分析法(radioimmunoas ay,RIA)放射
 
  免疫分析法具有高度的敏感性和特异性,可以分析到纳克(ng)数量级的浓度,操作简单、迅速。彭敏[19]等实验取静脉血1~2mL,分离血清,蒸馏水稀释,用海军医院标记的MTX药盒进行测定。材料:[3′,5′,7-3 H]-氨基甲基蝶呤钠盐,比放射性20居里/mmo1,Amer-sham;缓冲液:0.05M磷酸缓冲液,pH7.5,储于4℃备用;葡聚糖包被活性碳悬液;闪烁液。测定的标准曲线范围在10~160μg/mL。稀释血清使其位于有效浓度范围内。
 
  5.4荧光免疫分析法这也是一个应用较多的方法。冉国侠[18]等在类风湿性关节炎患者甲氨蝶呤的群体药代动力学研究中,患者初次服用MTX后24小时内,于0.5、1、1.25、1.5、1.75、2、3、4、5、6、8、10、12、24小时,采集血标本,分离血清测定。每患者取样点数3.9±0.5(3~5)。浓度观察值总数156,范围为(0~0.8μmo1/L)or(0~0.43mg/L)。甲氨蝶呤采用荧光免疫分析法(EPIA)在TDX仪(Abott,USA)上测定,试剂盒为Abott公司提供的原装试剂盒,检测灵敏度0.01μmo1/L,批内批间差异小于10。Morikawa等在分析肿瘤切除的空腔中脑脊液的MTX浓度时使用了荧光免疫分析法。在静注MTX0.5、1.5、3.5、6、18、24、48、72小时后取血浆和脑脊液。血浆样品迅速倒入装有肝素的试管中,离心,-40℃保存。脑脊液迅速在-40℃保存。血浆和脑脊液在一周内分析,用荧光偏振免疫分析法测定其中的MTX浓度(TDX,Abbott,North Chicago,IL)。10mL血浆和脑脊液样品用缓冲液稀释300倍。检测限0.02 mo1/L,日内和日间差异均小于5。所有病人给予的MTX剂量与药浓曲线下面积AUC都线性相关。血浆中MTX的药浓曲线服从双室模型,脑脊液中MTX的药浓曲线服从单室模型。MTX的测定方法另外还有紫外分光光度法、琼脂平板纸片法、酶免疫法等,近年来应用较少。现在应用最多的是高效液相色谱法。
 
  参考文献
 
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  [2]袁士诚,金有豫,杨景勋.国家基本药物.北京:人民出版社,1984.8.
 
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  [18]冉国侠,李红健,李江伟,等.类风湿性关节炎患者甲氨蝶呤的群体药代动力学.中国临床药理学杂志,2001(3),17(2):125~128.
 
  [19]Morikawa N,Mori T,Kawashima H,et al.Methotrexate con-centration in cerebrospinal fluid of the space created by tumor removal.Biol Pharm Bull,2000,23(6):774~777.
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