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抗艾滋病药物体内分析方法及药代动力学研究进展

2020-06-19 09:01 出处:未知 人气: 评论(0
  摘要:艾滋病(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的重大传染病,抗病毒治疗是目前临床上控制和治疗艾滋病的关键手段。近年来,高效、安全的新型抗艾滋病药物不断研发上市,抗病毒治疗方案得到了进一步优化。本文主要对抗艾滋病药物体内分析方法和药代动力学研究进展进行概述,以期为临床治疗药物监测及合理用药提供参考。
 
  关键词:艾滋病;抗艾滋病药物;体内分析方法;药代动力学
 
  艾滋病(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)是一种由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)攻击人体免疫系统引起的传染性疾病,也称获得性免疫缺陷综合征,是世界上严重威胁人类健康的疾病之一[1]。自首例艾滋病患者于1981年在美国疾控中心被确诊[2-3],全球已有3600多万人死于该疾病,且其发病率呈现逐年上升的趋势。长久以来,科学家们不断致力于新型抗艾滋病药物的研发,以期为临床抗艾滋病治疗提供新的策略。自1987年齐多夫定作为首个药物治疗HIV感染[4],迄今为止已有30余种药物通过美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于临床抗艾滋病治疗。针对HIV病毒的复制过程,抗艾滋病药物主要可分为融合酶抑制剂、逆转录酶抑制剂(包括核苷类与非核苷类)、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂以及CCR5受体抑制剂。单药治疗艾滋病,药物不良反应发生率高且易导致耐药的发生和传播[5],因此临床上抗艾滋病治疗方案已从单一药物治疗转移至联合药物治疗。高效抗逆转录病毒疗法(highly active antiretroviral treatment,HAART)是目前临床上控制、治疗艾滋病最有效的方法,由华裔学者何大一于1996年首先提出,即选用3种或3种以上的药物同时治疗,最大限度地抑制患者体内的HIV病毒,重建患者的免疫功能,提高患者的生活质量[6],其治疗方案主要由2种核苷类逆转录酶抑制剂+1种非核苷类逆转录酶抑制剂/强化蛋白酶抑制剂组成[7-9]。抗艾滋病药物的药代动力学研究对充分发挥其药理作用、提高用药安全性以及临床合理用药具有切实的指导意义,而建立快速、灵敏、可靠的体内分析方法为药代动力学特征研究提供了有力的技术支撑。本文主要对抗艾滋病药物体内分析方法进行简要的总结,并对其药代动力学研究进展进行了概述。
 
  1体内分析方法
 
  体内生物样品种类繁多、成分复杂,药物在生物样品中易受内源性物质的干扰且通常含量较低,因此需选择特异性好、灵敏度高、重现性好的体内分析方法[10]。目前,用于分析体内抗艾滋病药物浓度的方法主要有免疫分析(immunoassay,IA)法、高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法、毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)法等,其中HPLC法最为常用。
 
  1.1免疫分析(IA)法
 
  免疫分析法是基于抗原抗体特异性结合反应,利用被测药物同标记药物之间竞争抗体结合原理,再以放射计数、比色等方法进行定量分析的检测方法,具有灵敏度高、特异型强、样品用量少等特点[11]。由于IA法不存在分离过程,因而与待测药物具有相同抗原表面标志物的代谢物、内源性物质等均可干扰检测,从而对检测结果产生影响。体内样品中抗艾滋病药物浓度检测的IA法包括放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)法、酶联免疫分析(enzyme-linked immunoassay,ELISA)法、偏振荧光免疫分析(fluorescence polarization immunoassay,FPIA)法等。
 
  1.1.1放射免疫分析(RIA)法放射免疫分析法将放射性同位素的高敏感性与抗原抗体的特异性反应相结合,具有灵敏度高、特异性强、适用范围广、检测方便等优点。然而由于其只能检测具有免疫活性的物质,且存在放射性污染,故在临床上应用逐渐减少。
 
  齐多夫定是首个经美国FDA批准用于抗艾滋病治疗的药物,有研究报道齐多夫定对胎儿的造血功能有轻微的毒性。Huang等[12]采用RIA法对大鼠胎盘和胚胎中齐多夫定的浓度进行检测以研究核苷类逆转录酶抑制剂在母体-胎儿中的转移机制。Tadepalli等[13]建立了同时测定血清和尿液中齐多夫定及其葡糖苷酸代谢物的RIA法,该方法分析速度快、灵敏度高,测定结果与HPLC法相比一致性较好。
 
  1.1.2酶联免疫分析(ELISA)法酶联免疫分析法主要利用酶标记药物与样品中游离药物分子竞争性结合抗体的原理进行检测,具有灵敏度高、特异性强、操作简便快速、无辐射源等特点。
 
  Goujon等[14]建立了一种适用于细胞内单磷酸齐多夫定浓度水平检测的ELISA法,该实验通过测定不同齐多夫定浓度(0.01~10µmol·L-1)下培养的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)和单细胞源巨噬细胞(monocyte-derived macrophages,MDMs)中单磷酸齐多夫定的浓度验证了该方法的有效性,同时该方法灵敏度高(检测限为0.1 ng·mL-1)、准确性好、特异性强、交叉反应发生率低,为进一步研究齐多夫定在细胞中代谢生成二磷酸齐多夫定、三磷酸齐多夫定奠定了基础。Roucairol等[15]采用ELISA法定量检测血浆及细胞内阿扎那韦的浓度,特异性强,灵敏度高,血浆用量少,为阿扎那韦的临床药物浓度监测提供了经济、实用、有效的方法。Akeb等[16]采用ELISA法测定艾滋病患者血浆及细胞中利托那韦的浓度,并将其应用于长期采用联合药物疗法的艾滋病患者体内利托那韦血药浓度及细胞内外药物比例的检测。Bastiani等[17]采用ELISA法对血浆中安普纳韦的浓度进行了测定,经比较发现,ELISA法测定数据与HPLC法检测结果的相关性良好,且经Bland-Altman分析显示两种方法一致性较好。然而,生物体内复杂的内源性物质与药物代谢片段可能会对ELISA法检测产生干扰,增大实验结果误差[18]。Uglietti等[19]对比了ELISA法和HPLC法检测艾滋病患者体内奈非那韦及其活性代谢产物的浓度,结果显示采用ELISA法测得的浓度明显高于HPLC法,而除去ELISA法测得的奈非那韦代谢物M8的量后则显示差异无统计学意义,提示采用ELISA法对奈非那韦进行临床治疗药物浓度监测时,需考虑测定物中存在奈非那韦活性代谢物M8。
 
  1.1.3荧光偏振免疫分析(FPIA)法荧光偏振免疫分析法是利用荧光标记的药物与体内药物共同竞争抗体的原理进行检测分析,具有重复性好,灵敏度高、特异性强、操作简便易于掌握,自动化程度高等特点,是临床治疗药物浓度监测常用的方法之一。
 
  Granich等[20]采用FPIA法测定了血清中齐多夫定的浓度,其测定结果与HPLC法、RIA法一致。相对于HPLC法,FPIA法特异性强,灵敏度高,血清用量少;同时,通过β-葡萄糖醛酸酶水解前后测得齐多夫定的浓度,可以间接测定其代谢物齐多夫定葡糖苷酸的浓度,一定程度上弥补了代谢物检测的缺陷。FPIA对比RIA法,无放射性污染、安全。
 
  1.2高效液相色谱(HPLC)法
 
  高效液相色谱法是一种以经典液相色谱为基础,以高压下液体为流动相的色谱分析过程。采用HPLC法分析生物样品中抗艾滋病药物浓度,具有快速、高效、灵敏度高、专属性强、适用范围广等优点,常与紫外(UV)、荧光(FLD)、质谱(MS、MS/MS)等检测器联用,是近年来体内生物样品分析领域应用最为广泛的一种方法[21]。表1列举了采用HPLC法分析体内生物样品中抗艾滋病药物浓度的代表性实例[22-38]。
 
  1.2.1高效液相色谱-紫外检测(HPLC-UV)法紫外-可见光检测器包括可变波长检测器和二极管阵列检测器(PDA),是高效液相色谱中应用最为广泛的一种检测器,适用于有紫外吸收样品组分的检测,其检测灵敏度、精密度及线性范围良好。


  邹尚荣等[39]采用HPLC法同时测定人血浆中拉米夫定、齐多夫定和奈韦拉平的浓度。血浆经乙腈蛋白沉淀处理后以乙酸乙酯进行提取,检测波长为268 nm,定量限分别为50、50和100 ng·mL-1,可用于联合使用拉米夫定、齐多夫定和奈韦拉平进行抗病毒治疗的艾滋病患者的临床治疗药物监测及药代动力学研究。姚亚敏等[40]建立了一种快速、灵敏、重复性好的HPLC-PDA法测定人血浆中洛匹那韦的浓度。血浆样品采用乙酸乙酯液液萃取前处理方法,双波长同时检测(洛匹那韦210 nm,内标298 nm)。内源性物质不干扰样品的测定,洛匹那韦在1000~12 000 ng·mL-1与峰面积线性关系良好,适用于临床治疗药物浓度监测。Goldwirt等[41]建立了一种HPLC-PDA法定量检测人血浆中雷特格韦的浓度并成功应用于临床治疗药物浓度监测。经验证,该方法专属性良好,内源性物质及临床上联合使用频率较高的药物均不干扰雷特格韦的测定,雷特格韦在10~10 000 ng·mL-1与峰面积线性关系良好,适用于雷特格韦的临床药代动力学研究。
 
  1.2.2高效液相色谱-荧光分析(HPLC-FLD)法
 
  与紫外检测器相比,荧光检测器具有更高的灵敏度,其检测极限可达到1×10-10 g·mL-1,是体内药物分析常用的检测器之一。荧光检测器选择性高,适用于自身能发出荧光或经化学反应后可产生荧光的物质的检测。
 
  雷特格韦是美国FDA于2007年批准上市的第一代整合酶链转移抑制剂,临床上常用于抗HIV-1感染。Poirier等[42]采用HPLC-FLD法测定血浆中雷特格韦的浓度。血浆样品采用己烷/二氯甲烷(1∶1)液液萃取处理,离心后定量取有机层挥干,用流动相复溶后进样分析,荧光激发波长为299 nm,发射波长为396 nm,采用内标法(地拉夫定)定量,定量限为5 ng·mL-1。Verbesselt等[43]对人血浆中安普纳韦浓度测定分析的HPLC-FLD法和HPLC-UV法进行了比较。结果表明,采用荧光法进行检测时,安普纳韦的定量限为25 ng·mL-1,灵敏度更高,且由于荧光检测器只对产生荧光的物质有响应,避免了血浆中内源性基质的干扰,专属性良好。
 
  1.2.3高效液相色谱-质谱/串联质谱检测(HPLC-MS、HPLC-MS/MS)法MS检测灵敏度高、特异性好、样品用量少、分析速度快,通用性强,能为化合物定性提供较多的结构信息,是一种理想的色谱检测器,越来越广泛地应用于抗艾滋病药物的体内分析。
 
  Takahashi等[44]建立了LC-MS法对人血浆中雷特格韦的浓度进行测定。血浆样品采用液液萃取前处理方法,挥干复溶后进样,正离子选择离子监测(SIM)模式下进行检测分析。结果显示,雷特格韦在0.01~7.68µg·mL-1与峰面积线性关系良好,精密度、准确度良好,回收率稳定,适用于雷特格韦的临床治疗药物浓度监测。利匹韦林是一种二代非核苷类逆转录酶抑制剂,对野生型和耐药型HIV-1菌株均有良好的抑制活性。在HPLC法定量分析体内利匹韦林血药浓度的基础上,Shibata等[45]建立了更为简便、灵敏、快速的LC-MS法测定血浆中利匹韦林的浓度。利匹韦林在0.018~0.715µg·mL-1与峰面积线性关系良好,定量限为0.018µg·mL-1,满足临床上患者利匹韦林血药浓度的测定。Amara等[46]采用LC-MS法对干血点中依非韦伦的浓度进行定量,分析时间仅为5 min,适用于临床上样本的大批量检测分析。
 
  MS/MS能够实现多离子反应同时检测,与MS相比具有更高的灵敏度和选择性。Reddy等[47]采用了HPLC-MS/MS法测定人血浆中拉米夫定、齐多夫定及奈韦拉平的浓度。血浆样品采用固相萃取前处理方法,API 4000(Applied Biosystems,USA)三重四级杆检测。拉米夫定、齐多夫定和奈韦拉平分别在9.47~1466.67 ng·mL-1、10.32~1600.00 ng·mL-1及15.05~2426.67 ng·mL-1与峰面积呈现良好的线性关系,在该方法下样品分析重复性好,回收率高,分析时间仅为4.5 min。Tsuchiya等[48]建立了一种快速、灵敏、准确的LC-MS/MS法测定人血浆和脑脊液中3种HIV-1整合酶链转移抑制剂的浓度。血浆样品采用乙腈沉淀蛋白,雷特格韦同位素作为内标,各药物在血浆中的线性范围均为5~1500 ng·mL-1,在脑脊液中的线性范围均为1~200 ng·mL-1,日内和日间精密度均小于15%,分析时间为5 min。HIV蛋白酶抑制剂阿扎那韦、利托那韦与核苷类逆转录酶抑制剂替诺福韦联合用药为临床推荐使用的HAART治疗方案。为评估临床上患者服用该药物组合的依从性及服用后药物的暴露量,Koehn等[49]建立了一种同时测定人血浆及外周血淋巴细胞中阿扎那韦、利托那韦和替诺福韦浓度的LC-MS/MS分析方法。经液液萃取结合蛋白沉淀处理后,血浆样品中3种药物的回收率均大于92%,细胞样品大于86%。在该分析方法下,血浆及细胞中的内源性物质均不干扰药物的测定,阿扎那韦、利托那韦和替诺福韦在1~1000 ng·mL-1与峰面积线性关系良好,其检出限分别为0.002、0.05、
 
  0.5 ng·mL-1,灵敏度高。
 
  1.3毛细管电泳(CE)法
 
  毛细管电泳是一种以毛细管为分离通道,以高压电场为驱动力,利用样品不同组分之间电流淌度或分配行为的差异而实现分离的分析技术,具有快速、高效、微量、灵敏度高、应用范围广、成本低、操作简便可高度自动化等特点,是近年来分析领域中发展速度最快的分离分析技术之一。
 
  赵莉等[50]建立了一种简便、快速、微量、专属性好的CE法测定大鼠尿液中拉米夫定的浓度。以20 mmol·L-1磷酸缓冲液作为运行缓冲液,采用未涂层熔融石英毛细管柱(45 cm×75µm,有效长度为36.7 cm),尿液样品经蛋白沉淀后,在270 nm波长下进行检测。拉米夫定在20~1000µg·mL-1与峰面积线性关系良好,日内及日间精密度均小于10%,回收率高。Alnouti等[51]采用胶束CE法测定了大鼠血浆、羊水和胚胎组织样品中齐多夫定及齐多夫定单磷酸的浓度。该方法简便、灵敏,适用于齐多夫定在怀孕大鼠中的药代动力学研究。Alain等[52]建立了一种同时检测人血浆中齐多夫定、司他夫定、拉米夫定及奈韦拉平浓度的胶束电动CE法,且成功应用于艾滋病患者接受抗病毒治疗过程中的临床治疗药物浓度监测。
 
  2药代动力学研究进展
 
  药代动力学主要是定量研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄的过程,并运用数学原理和方法阐明药物在机体内动态变化规律的一门学科,已成为药物临床前研究和临床研究的重要组成部分[53]。本文对抗艾滋病药物在生物体内的吸收、分布、代谢及排泄等过程作一概述,为其后期的临床研究及合理使用提供参考。
 
  2.1药物动力学研究
 
  姜莉苑等[54]研究了富马酸替诺福韦二吡呋酯胶囊在中国人体内的药代动力学特征。健康受试者依次进行低剂量(300 mg)单、多次给药;高剂量(600 mg)单次给药和饮食影响低剂量单次给药的药代动力学试验,采用LC-MS/MS法测定人血浆中替诺福韦的浓度,求得药代动力学参数。结果发现,替诺福韦在300~600 mg剂量范围内呈线性药代动力学特征,体内过程不受性别差异的影响;高脂餐后给药tmax延迟,AUC0~72 h提高;多次给药达稳态后,血药浓度波动较大且暴露量显著增加。不同类型的口服制剂在体内释放吸收特点可能不同,Chokephaibulkit等[55]考察了新型儿科药物组合(齐多夫定/拉米夫定/奈韦拉平)片剂与液体制剂在艾滋病儿童患者中的生物等效性及短期安全性,并对采集的Buccal-swab样品进行了细胞色素P450 2B6(CYP2B6)基因多态性分析。结果发现,两种制剂在短期内耐受性较好。口服给药片剂与液体制剂后齐多夫定的药物暴露量相当,拉米夫定片剂中的暴露量较液体制剂明显升高,但与其他品牌含拉米夫定组合片剂中的暴露量相符;奈韦拉平在片剂中的暴露量较低,但仍能满足治疗要求,且其暴露量与儿童患者体内CYP2B6基因多态性密切相关。Mulligan等[56]比较了度鲁特韦在妊娠期及产后艾滋病妇女患者体内的药代动力学过程,发现在每日给药一次的情况下,妊娠期艾滋病妇女患者体内度鲁特韦的暴露量低于产后,平均AUC0~24 h与正常人接近,谷浓度相对较低,但高于90%有效浓度(EC90)。度鲁特韦在母体内能通过胎盘屏障进入新生儿体内,且其在新生儿体内的消除时间较长,为成人对照的2倍左右。
 
  2.2组织分布研究
 
  Curley等[57]采用虚拟模型法和LC-MS/MS法研究了依非韦伦在血浆、脑脊液及脑组织中的浓度及蓄积状况。结果显示,依非韦伦在大鼠脑组织中的浓度高于脑脊液及血浆中的浓度,与虚拟模型及临床数据得出的结论相符。分析原因,可能与依非韦伦药物本身的物理化学性质(高脂溶性、高渗透性)及血浆蛋白结合率高有关。Mascio等[58]采用正电子成像发射断层扫描法研究替诺福韦的组织分布动力学。从研究结果中可以发现,替诺福韦在肾脏中产生蓄积,浓度较高,临床上艾滋病患者长期服用该药物可能会产生肾毒性不良反应。其次是肝脏、颌下淋巴结、肺、空肠、结肠等,替诺福韦属于极性小分子化合物,不易通过血脑屏障进入脑组织,因此在脑中的含量很低。Patterson等[59]通过研究发现整合酶抑制剂雷特格韦口服给药后迅速分布于胃肠组织及内脏相关淋巴组织中,在胃肠组织中的浓度显著高于血浆,是迄今为止在胃肠组织中暴露量最高的抗逆转录病毒药物,提示雷特格韦对胃肠组织及内脏相关淋巴组织具有潜在的毒性
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