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亲水作用色谱在体内药物定量分析中的应用进展

2020-06-15 14:55 出处:未知 人气: 评论(0
  摘要亲水作用色谱(HILIC)是一种结合了亲水性固定相与极性有机溶剂-水体系流动相的色谱分离技术,对反相色谱中难以保留的极性化合物能够实现有效分离。近年来,将HILIC-串联质谱联用技术(HILIC-MS/MS)应用于体内药物定量分析的报道已引起广泛关注。本文简要介绍了HILIC的定义和机制,并综述了其在体内药物定量分析中的应用进展。
 
  关键词亲水作用色谱;体内药物分析;极性化合物;定量分析
 
  体内药物分析是对体液或组织中药物及其代谢物、生物标记物等进行的定性或定量分析。由于生物基质成分复杂,对目标分析物检测手段的选择成为需要密切关注的问题。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)因其高度的选择性和专属性,已成为体内药物分析的首选工具。
 
  长期以来,反相液相色谱在体内药物定量分析领域占据主导地位,其与质谱的联用通常对特定分析物能获得单一色谱峰。反相色谱固定相的各种化学键合填料主要以硅胶为基质,由于键合不完全,碱性药物可能与残留的硅羟基发生作用,致使色谱峰拖尾[1];药物衍生成分,如前药和药物代谢物,也可能在质谱离子源发生源内裂解,产生与母药相同的带电离子[2]。生物基质中还含有其他多种亲水性组分,包括内源性物质,如盐类、胺类、脂肪酸、磷脂以及外源性物质(如药物辅料聚乙二醇、环糊精、聚山梨酯类表面活性剂等),当目标化合物在反相色谱保留较弱时,可能会与这些成分发生共洗脱[3]。由于极性化合物更易发生共洗脱现象,基质效应对其定量分析产生的干扰更加严重,若使用高水比例的流动相增加极性分析物在反相色谱上的保留,则质谱检测的灵敏度将受到损失,同时色谱柱填料易受损,性能下降。正相液相色谱(normal-phase liquid chromatography,NPLC)虽能通过样品在强极性的固定相和极性更强的洗脱剂间的分配达到分离目的,但应用于大多数亲水性强的样品时,其与水不互溶的有机流动相无法提供足够的溶解度,同时易出现样品峰形差、保留时间漂移等问题。
 
  亲水作用色谱(hydrophilic interaction chromatography,HILIC)的概念于1990年由Alpert首次提出[4],是一种采用极性固定相(如硅胶或衍生硅胶)和含高浓度极性有机溶剂(如乙腈)和低浓度水溶液流动相的色谱模式,具有和反相色谱正交的选择性。HILIC所使用的流动相与传统反相色谱相似,弱洗脱剂为有机相,强洗脱剂为水相,可达到与反相色谱相媲美的柱效和对称峰形;化合物的洗脱顺序则与正相色谱相似,即以亲水性增加的顺序流出,能为亲水性、强极性的化合物提供合适的保留,含水的流动相又可显著改善样品的溶解度。因此,HILIC特别适合于强极性、亲水性样品的定性定量分析[5]。
 
  近年来,对HILIC理论探讨、新型固定相选择和实际应用等方面的研究报道日益增多,以“HILIC”或“hydrophilic interaction liquid chromatography”为主题词,Web of Science数据库收录的文献数目在1990~2003年为197篇,2004~2008年为399篇,而从2009~2012年3月约3年时间内已有635篇。Weng[6]于2003年发表了首篇将HILIC应用于体内药物分析的综述。HILIC对极性化合物的良好保留和独特选择性,已使其成为体内药物定量分析的重要补充工具。
 
  1HILIC的固定相
 
  目前已上市多种商品化的HILIC专属色谱柱,包括未经衍生化的硅胶柱,或在硅胶或聚合物基质表面键合有极性基团,如酰胺基、聚琥珀酰亚胺及其衍生物、磺烷基三甲胺乙内酯、环糊精等,聚合物基质的HILIC色谱柱表现出更好的稳定性。实际上,应用于正相色谱的多数色谱柱如未经衍生化的普通硅胶柱、胺基柱和氰基柱等都能兼容HILIC模式[7],甚至一些反相柱在HILIC模式下也可对碱性化合物实现良好分离[8]。两性离子型亲水作用液相色谱柱(zwitterionic hydrophilic interaction liquid chromatogra-phy,ZIC-HILIC)的应用近年来发展迅速[9]。最近对10种氨基糖苷类药物在多种HILIC柱上色谱行为的系统研究表明[10],ZIC-HILIC与未修饰硅胶柱、氨基柱和酰胺柱相比能实现最佳分离;柱温、pH影响检测灵敏度而与保留时间无关;流动相中的离子强度影响峰型和保留时间。关于新型固定相的研究很多,但目前未经衍生化的硅胶柱仍为HIL-IC分析中最为常用的固定相[11]。
 
  2HILIC分离机制
 
  HILIC的分离机制较为复杂,一种广泛接受的机制假设是:极性固定相吸附的富水层与低水含量的流动相间形成了液-液萃取体系,化合物在两相间进行分配[12]。同时,亦有吸附、离子交换等机制假说和氢键、偶极作用等次级作用[13],其分离效果受到多种因素制约,如流速、柱温、固定相键合的基团、缓冲体系pH、缓冲盐的种类和浓度等。
 
  由于各种作用影响程度的不同,可能产生不正常的峰形,因此在使用HILIC体系分析化合物时控制参数尤为重要,以使样品主要以单一机制进行保留。通常在HILIC分离中采用5~20 mmol/L的挥发性缓冲盐,常用的有甲酸铵、乙酸铵和重碳酸铵。Quiming等[14]的研究表明,在HILIC模式中影响样品保留的关键因素是流动相中有机相的比例,如增加乙腈含量将显著增加化合物保留因子。Dinh等[15]亦在多种商品化HILIC柱上证实,增加水相比例将减少氢键作用,降低选择性。同时,减小固定相孔径可延长保留时间,但对选择性影响甚微,粒径则对二者均无影响。
 
  3HILIC进行体内药物分析的特点
 
  传统的正相系统因使用非极性的有机相,生物样品中极性的内源性杂质会因强保留而累积在色谱柱上造成柱损坏,使用HILIC时,极性杂质常可被极性的流动相洗脱。但由于一些肽类、糖类和其他极性代谢物仍可能发生累积,有可能产生基质效应使离子源信号升高或降低。除尽可能使用同位素内标、大气压化学离子化源(atmospheric pressure chemical ionization,APCI)等方法避免或减少基质效应外,使用梯度洗脱或调节流动相组成(如pH、离子强度)亦可能有效,通过改变前处理方式消除磷脂带来的基质效应也有报道[16]。
 
  如前所述,未经衍生化的普通硅胶柱目前是应用最为广泛的HILIC色谱柱,对于碱性药物,需要酸性的流动相,未衍生硅胶柱在HILIC模式下因处于高有机相环境中,不会如处于反相色谱条件时那样易溶解。同时,HILIC还能获得高的色谱柱效、对称的峰形。HILIC以高浓度有机溶剂和低含量水组成的流动相,具有低黏度和高渗透性的特点,与相似柱粒径和流速的RPLC相比,色谱柱压大大降低,因此可在高流速下以低反压进行分离,从而实现快速分析。HILIC所使用的高挥发性有机相尤其适宜与电喷雾(ESI)质谱联用,可提供良好的灵敏度。由于HILIC进样时采用高比例有机溶剂,生物样品制备过程最后一步无需以高水相有机溶剂复溶,可有效提高样品通量[17],对不稳定或不适合蒸发-复溶的分析物还可得到更低的检出限和更高的回收率。
 
  4HILIC在体内药物分析中的应用进展
 
  近年来,HILIC的应用领域有所拓宽,其特有的高灵敏度、低柱压、无需复溶的简便前处理等优势亦可能扩展到非极性药物、多肽蛋白类药物的分析上。因水在HILIC系统中是强洗脱剂,为增加保留可控制在2.5%~5%以内,甚至用较强极性的有机溶剂(如甲醇、乙醇或异丙醇)取代部分水相,以获得更强的保留,从而扩展HILIC的适用范围。Xue等[18]通过采用85%MTBE和15%的ACN-水(90∶10)的等度流动相,将水的比例控制为1.5%,建立了对人血浆中相对非极性的药物muraglitazar的定量方法,经LLE前处理的样品可直接进样,信号强度达到了以RPLC分析时的4倍。在研的2型糖尿病治疗药物taspoglutide是胰岛素样多肽药物,在生物样品中含量甚低。Heinig等[19]改进了已有的检测方法,通过正交的HILIC-RPLC柱切换,采用以碱性流动相与ESI正离子模式相结合的“反方向”(wrong-way-round)离子化方式,显著提高了化合物信号,使得血浆和尿液样品以简单的蛋白沉淀作为前处理即可达到皮克级检测限。
 
  HILIC在体内药物定量分析中最突出的优势仍集中表现在对强极性、亲水性小分子的分离上。作为RPLC的重要补充工具,HILIC在药物代谢动力学、治疗药物检测和临床诊断及代谢组学研究等方面均显示了良好的适用性和不断拓展的应用潜力。
 
  4.1在药物代谢动力学研究中的应用
 
  现代合成化学的进展已使得多种多样的化学实体得以合成,供医药产业进一步筛选和研发具有治疗作用的化合物。相应地,对需要进行药物代谢动力学分析的生物样品数目增多,也对更高的通量和更低的定量检出限提出了挑战。在反相色谱中,保留取决于溶质的亲脂性,而在HILIC系统中药物保留不取决于亲脂性,能同时分离极性范围更大的药物,特别有利于药物代谢动力学研究[20]。
 
  由于药物作用的强度通常与药物在血浆中的浓度(血药浓度)成正比,体内药物定量分析中最常见的生物基质是血浆,有时也为血清或全血。Ji等[21]建立了HILIC/ESI-MS/MS定量分析血浆中乳腺肿瘤生长抑制药阿那曲唑(anastrozole)的方法,用于支持其药物代谢动力学研究。与RPLC分析相比,HILIC具有更低的定量下限(0.1 ng/mL)。一项硬膜外麻醉的临床研究中,患者同时注射低剂量舒芬太尼(sufentanil),该药半衰期短,血药浓度低,已报道的GC-MS和RPLC-MS方法其检测灵敏度均不能达到要求[22],以HILIC-MS/MS建立的血浆中舒芬太尼的定量方法则取得了低达0.25 pg/mL的定量下限,成功应用于接受硬膜外麻醉的产妇及其新生儿脐带血中舒芬太尼含量的测定。蛋氨酸(methionine)是可防治脂肪蓄积以保护肝脏的氨基酸类药物。Xu等[23]建立了大鼠血清中1-(13)C-L-蛋氨酸的HILIC-MS/MS定量方法,通过乙腈沉淀蛋白取上清的简单前处理,在氨基柱上梯度洗脱。该方法已应用于大鼠体内1-(13)C-L-蛋氨酸的药代动力学研究。
 
  为研究药物在体内的分布状况,对尿液中的药物及其代谢产物进行测定非常必要。由于尿液含有大量的代谢废物、盐类和极性有机化合物,成分复杂,可能与待分析的极性化合物表现出类似的理化性质,在样品制备和色谱分离时很难排除干扰。与RPLC相比,HILIC对干扰物有更佳的分离度和更高的灵敏度,对尿液样品有时直接稀释即可进样。阿片类药物经肝代谢后大部分由尿中排出,其原药及其代谢产物极性较大,使用HILIC对一种或几种原药和/或代谢物进行测定已多见报道。如Kolmonen等[24]以HILIC与飞行时间质谱联用,同时检测人尿液中吗啡(morphine)、可待因(codeine)、吗啡-6-葡萄糖醛苷(M6 G)、吗啡-3-葡萄糖醛苷(M3 G)和可待因-6-葡萄糖醛苷(C6 G)含量。代谢物M6 G和M3 G为异构体,其色谱分离较为困难,而采用HILIC分析实现了良好的分离。
 
  在中枢神经系统的药物临床前研究中,了解组胺等细胞外神经递质在给药前后脑透析液中的浓度变化有助于解释候选药物作用机制。因细胞外神经递质浓度极低,使用微透析技术得到的样品量少且无机盐含量高,对其检测和定量被视为主要的技术难点。Bourgogne等[25〗将柱前衍生化与HILIC-MS/MS结合,建立了定量分析大鼠脑透析液中组胺及其主要代谢物1-甲基组胺的方法,仅需10μL脑透析液即可达到83.4 pg/mL和84.5 pg/mL的定量下限。固相萃取(SPE)与HILIC结合使用的分析方法多见报道。在一项检测犬血浆中葡糖胺(glucosamin,关节炎辅助用药)的HILIC-MS/MS方法中,SPE降低了样品基质干扰和离子抑制作用,提高了检测灵敏度[26]。化合物3-deazan-eplanocin A(DZNep)已经证实可诱导肿瘤细胞凋亡,是一全新的抗肿瘤候选药物,需要开展相关的药物代谢动力学研究。Sun等[27]开发了检测大鼠生物样本(血浆、尿液、粪便及组织)中DZNep含量的HILIC方法,采用SPE作为复杂样品的前处理手段。抗病毒药物扎那米韦(zanamivir)作为治疗禽流感的药物,其仿制药在我国已通过临床前注册评审,获准进入临床研究阶段。使用传统RPLC分析方法,扎那米韦具有不易保留、灵敏度低的缺陷。Lindegardh等[28]使用96孔板和SPE前处理,开发了定量分析血浆中扎那米韦的HILIC-MS/MS方法,具有所需样品量少(50μL)、高通量且高灵敏度的优点,实现了符合FDA法规的方法学验证,可应用于扎那米韦注射剂和吸入剂的药代动力学研究。
 
  近年来热门的干血点(dried blood spots,DBS)技术因具有无需样品制备,可快速、实时分析的优点而引人关注,但其较小的生物基质样品体积使得检测灵敏度成为一大难点。将DBS技术与HILIC相结合,检测全血中扎替雷定(zatebradine)含量,与RPLC相比,灵敏度提高多达5倍(至5~5 000 pg/mL的线性范围),显示出这一技术诱人的应用潜力[29]。
 
  采用HILIC技术检测强极性的氨基酸类药物具有突出优势。去羟肌苷(didanosine)是一种治疗获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的药物,由于生物利用度低,研发人员合成了其氨基酸类的前药valdidanosine,通过SPE前处理的UP-LC-HILIC-MS/MS方法可同时测定大鼠血浆中去羟肌苷和valdidanosine的含量,与原有HPLC-UV方法相比,分析速度更快,灵敏度更高,成功应用于大鼠灌胃给予去羟肌苷原药或前药的药代动力学研究[30]。
 
  4.2在治疗药物监测和临床诊断中的应用
 
  开展治疗药物监测(TDM),对治疗指数小、药动学行为呈非线性、个体差异大的药物和长期用药、肝肾功能不全等患者具有重要临床意义,可使给药方案个体化以提高药物疗效,避免或减少不良反应;同时也为药物过量、药物中毒的诊断和处理提供有价值的实验室检查依据。HILIC的应用已经扩展到治疗药物监测领域。利托君(ritodrine)是临床常用于延长妊娠期的β2肾上腺素受体激动剂,具有较强的亲水性,其血药浓度较高时对心血管系统和代谢产生不良反应,需要密切监测。已报道的RPLC或荧光检测方法需要较大体积的采血量,不适于对胎儿或新生儿体内利托君的检测。采用Ohmori等[31]建立的HILIC-MS/MS方法仅需50μL血清即可实现对母婴血清中利托君的含量测定,灵敏度达0.39 ng/mL。Qin等[32]建立了同时检测尿液中7种雌激素结合物的HILIC-MS/MS方法,以SPE作为样品前处理手段,提高了方法灵敏度并消除了干扰,可灵敏反映服用雌激素治疗的乳腺癌患者在不同生理及治疗阶段尿液中7种雌激素结合物含量的阶段性变化。尼古丁是烟草中导致成瘾的主要成分,具有较大的极性。Dobrinas等[33]采用HILIC色谱柱,以固相萃取为前处理方法,结合超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)建立了人血浆中尼古丁及其代谢产物的定量检测方法,成功应用于戒烟受试者的临床研究,实现了该研究高通量、高灵敏和高专属检测的要求。
 
  临床诊断是对患者疾病的病因、发病机制作出分类鉴别,通常需要检验指标进行辅助,针对性地制定治疗方案。肉碱(carnitine)是一种类氨基酸,系临床诊断多种先天性代谢综合征的重要指标。目前对其检测通常采用柱前衍生化结合RPLC以获得较好保留和离子化效率,但衍生化所需的酸性条件可能同时水解其他酰基酯类,对目标化合物检测造成干扰。Sowell等[34]开发了以HILIC技术检测人血浆中总肉碱含量和未经蛋白结合的肉碱含量的方法,经优化至合适的色谱条件后,无需衍生化即可直接进样分析。嘌呤代谢的终产物尿酸(uric acid)在血浆和尿液中的含量与多种疾病具有相关性,是临床常需检测的指标之一,以往常采用酶转化和比色法进行测定;肌酐(creatinin)则是反映尿液稀释和肾功能的生物标记物。通过稀释、蛋白沉淀、离心和过滤,尿酸和肌酐可从尿液样本中分离出来,并采用HILIC技术进行同时检测,定量下限分别为0.04μg/mL(肌酐)和0.06μg/mL(尿酸)[35]。
 
  4.3在代谢组学研究中的应用
 
  代谢组学(metabolomics)是后基因组学时代兴起的一门跨领域学科,其主要目标是定量研究生物体对外界刺激、病理生理变化以及本身基因突变等刺激或扰动产生的代谢产物变化或其随时间的变化。由于代谢组学的研究对象主要是内源性小分子,面临着分析物种类繁多、鉴定难度大、成分复杂、各组分含量差异大、样本量多等多种挑战。Guo等[36]比较了采用RPLC-MS和HILIC-MS方法分析人尿液中常见含氮类化合物的区别,发现HILIC-MS对于这些极性化合物的灵敏度较高,且能检出的该类代谢物数目也远多于RPLC-MS法。Creek等[37]在HILIC-MS系统上构建了基于代谢物化学结构的保留时间预测模型,以期在实际应用中鉴定出更多的代谢物。磷脂是生物体内具有多种重要生理功能的一类内源性物质,Zhu等[38]采用通常用于正相色谱的二醇修饰硅胶柱建立了同时检测血浆中7种磷脂的LC-MS/MS方法,为改善峰形水相中使用了较高浓度的缓冲盐(有机相含53 mmol/L甲酸,水相含53 mmol/L甲酸和60 mmol/L甲酸铵)。
 
  一维色谱与质谱联用时,在死时间内流出的色谱峰通常被排除在后续数据分析过程之外,得到的代谢产物信息缺失,而综合采用RPLC及HILIC提供的信息,可提供较为全面的代谢物数据[39]。Idborg等[40-41]以固相萃取方法先将鼠尿液粗分为淋洗液和洗脱液两部分,分别采用ZIC-HILIC柱和反相C18柱,与MS联用进行分析,以同时得到亲水性和疏水性组分的样品信息。Wang等[42]通过构建新型流路,实现了RPLC和HILIC在线联用分析复杂体系样品。通过将HILIC色谱柱上死时间内流出的代谢物组分在线转移到RPLC色谱柱上进行分离的方法,使样品中的亲水性和疏水性组分可分别在合适的分离模式下分析,体现出二维液相色谱系统的优点,得到更加全面和准确的代谢组学研究结果。
 
  5结语与展望
 
  HILIC色谱条件与样品前处理中所用有机溶剂兼容,可节约大量样品前处理时间,并与质谱尤其是ESI离子源质谱良好兼容,适用于药物研发中药理毒理学评价、药代动力学研究、治疗药物监测和临床诊断研究中的高通量分析。实际上,HILIC的应用领域已不再局限于极性小分子药物及代谢物,相对非极性的化合物和多肽蛋白类药物的成功分析亦见报道[43]。通过构建新型流路,HILIC与反相色谱的离线或在线结合应用可极大提高对复杂体系样品的分离效率,尤其适合代谢组学研究。
 
  具有独特选择性的新型HILIC填料不断面世[44-45],提供了更高的柱效、更广的选择性和更好的耐用性。亦有采用HILIC固定相作为SPE填料的报道,对复杂基质中亲水性样品进行除盐等预处理[46]。近年来,可用于HILIC分离的毛细管整体柱[47]和HILIC-微控流芯片[48]等新技术不断兴起,拓宽了HILIC的应用领域。更有绿色化学的研究者发现,HILIC流动相如使用含高浓度二氧化碳的乙醇-水体系,能达到与高污染的传统乙腈-水体系相似的色谱表现[49],在化学研究更加关注环保的今天具有重要启发意义。
 
  实际应用中,HILIC也还存在一些问题,如通常比反相色谱需要更长的平衡时间,因柱超载引起的峰形改变和保留时间漂移等。随着HILIC在体内药物分析应用逐渐广泛,系统研究并阐明其分离机制将是今后的重要研究课题之一。
 
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