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毛细管电泳应用于体内药物分析的富集技术

2020-06-09 09:23 出处:未知 人气: 评论(0
  近几年来,毛细管电泳(CE)得到了快速发展,几乎已包括了板电泳与高效液相色谱的所有分离对象,这主要归功于它可提供比高效液相色谱高两三个数量级的分离效率,尤其是分析复杂的生物样品或样品量有限时。但100μm内径以下的毛细管柱的采用却使其浓度检测灵敏度受到限制,采用通用型紫外线检测器时一般仅可达10-6m ol/L,比高效液相色谱低一两个数量级,使其在许多实际应用特别是在体内药物分析中远远不能满足要求。由于样品负荷小,进样量一般只有几十纳升,所以对检测器的灵敏度要求较高。
 
  目前,提高毛细管电泳检测灵敏度的方法主要有3种:采用特殊设计的毛细管和检测池,采用更高灵敏度的检测器,采用样品浓缩技术。
 
  样品浓缩技术是采用特殊的进样过程将大体积样品溶液中的痕量被测物浓缩后进行分离,从而提高检测灵敏度的一种技术。毛细管电泳中的样品浓缩技术有柱上浓缩与柱前浓缩之分:柱上浓缩是在不改变毛细管电泳系统时进行,将大体积样品直接引入分离毛细管后,在电泳前采取适当的措施进行浓缩,然后直接进行电泳分离;柱前浓缩是在改变毛细管电泳系统时进行,一般在分离毛细管前增加一段预柱,大体积样品首先被引入预柱中采取适当措施进行浓缩,然后部分或全部被引入分离毛细管柱中进行分离。近年来在毛细管电泳应用中出现了各种富集技术,如等速电泳、电堆积、场增加进样、色谱预浓缩等。
 
  1等速电泳
 
  等速电泳(I TP)[1,2]作为柱上预浓缩技术是在流体动力进样后实现的,是电流通过不连续电解质系统而引起的电泳,样品区带介于前导电解质和尾随电解质之间。毛细管两端加上电压后,电位梯度的扩散使所有离子最终以同一速度泳动,样品离子按其淌度和电离度大小,得到相互连接而不重叠的梯形带。在ITP同时施加一与电渗流反方向的流体动力压力,压缩样品区带,防止待测组分移出毛细管。I TP稳定后,关闭反向压力,加电压使样品带移至进样端口,进行区带电泳(CZE)。如果采用2种不同内径的毛细管柱,较大口径的用于ITP,较小口径的用于CZE,可进一步增加进样体积,提高痕量组分浓度。但ITP时间为1h以上,限制了IT P-CZE在生物分析中的应用,例如M azereeuw等[3]用此方法测定抗毒蕈碱类药物新斯的明和普鲁本辛,当样品浓度为2.5nm ol/L时,进样20.8μl,仍能检测出信号,但浓缩时间长达2h左右。
 
  将液一液电提取(EE)与ITP结合起来,可缩短浓缩时间。样品溶于有机相,加上电压后带电化合物迅速进入毛细管中小体积缓冲液中,再进行IT P,进一步浓缩,IT P只需几分钟即达稳定状态。例如Vandervlis等[4]采用EE-I TP-CZ E方法测定普鲁本辛、新斯的明、间羟叔丁肾上腺素,只需几分钟,大大缩短了分析时间,且新斯的明、普鲁本辛的检测限达5nmol/L,间羟叔丁肾上腺素的检测限达1nmol/L,可用于临床分析。
 
  2电堆积富集
 
  电堆积富集[5]作为一种样品柱上浓缩技术在流体动力进样后实现。它将样品溶解在稀释后的载体电解质溶液中,则样品溶液的电阻率大于载体电解质溶液,导致流体动力进样后在外加电压下分配在样品区带内的电场强度高于充满载体电解质溶液的毛细管柱的其它部分,则样品区带内的样品离子在高电场强度作用下迁移速度加快。但当样品离子迁移到样品溶液与载体电解质溶液的边沿时,又会在低电场强度的作用下放慢迁移速度,样品离子在样品溶液和背景电解质交界处发生堆积而得到富集。
 
  电堆积条件下进样量的提高受到层流的限制,它使得电堆积后的样品离子发生扩散。由于样品区与充满背景电解质部分场强不同,其局部电渗流亦不同,可导致样品区带与充满背景电解质部分存在速度不同的层流,降低分离效率。如在保持电堆积效应的同时降低层液,则限制进样量的条件可被打破。进样量取决于待测物的表观电泳速度(V ap),Vap=0时,所对应的样品区带长L=X 0(柱长),若L>X 0,V ap与电渗流同方向,不发生堆积;L<X 0,Vap与电渗流反方向,发生堆积。当进样体积为毛细管体积的50时,不影响分离效率,灵敏度提高10倍~20倍。如果采用电渗流改性剂动态涂布的石英毛细管,进样后样品区内电渗流改性剂解吸附,新形成的电渗流将样品迁移出毛细管,待测组分堆积,进样体积可达毛细管总体积的80,灵敏度提高30倍~40倍。
 
  Palm arsdot tir等[6]采用2次连续堆积方法,即将处理过的血清样品充满整个毛细管,采用2种浓度的缓冲液进行连续堆积,对只有较弱紫外吸收的碱性药物班布特罗的检测限达4nm ol/L。背景电解质中添加β-环糊精后,可对其进行手性分离,检测限亦可达4nm ol/L。
 
  3电动胶束色谱
 
  从理论上讲,电堆积富集只能应用于带电离子,但Liu等[7~9]却将其成功地应用于中性物质和弱酸弱碱性化合物,提出了中性分子和弱酸性化合物的富集技术。采用这种富集技术可以压缩样品带的宽度从而提高柱效,在此基础上通过加大进样量使化合物的检测灵敏度提高近两个数量级。
 
  3.1中性分子的柱上富集
 
  电动胶束色谱(M EKC)是用不含缓冲液、低浓度(略高于CMC点)的表面活性剂作为样品溶剂。由于化合物的脂溶性较强,易溶于胶束相中,则进样后施加电压的瞬间由于样品带的电阻离,电压差大,造成负电荷的胶束相携带中性分子样品在样品带与高离子强度的运行缓冲液界面处富集。
 
  Liu等[7]采用MEKC方法,对1、2、4、7和1、2、4、8 TCDDs进行了测定,灵敏度比原来提高一个数量级。采用柱上富集技术后,可以加大进样量而不影响分离,进样量达80 nl~160nl。
 
  3.2弱酸性和弱碱性化合物的柱上富集
 
  由于弱酸弱碱存在酸碱平衡关系,若直接用上述富集技术,不能达到最佳富集效果。吴惠芳等[8]提出用含有低浓度缓冲液和低浓度胶束的溶液作样品溶剂的富集方法。对于弱酸性化合物的富集,将样品溶剂的pH值调至小于Pka-1(P ka为所测化合物中最低者),这样,化合物将主要以分子形态存在,溶解于胶束相中,在进样后施加电压的瞬间,胶束相携带样品分子在样品带与缓冲液的界面处富集;对于弱碱性有机化合物的富集,将样品溶剂的pH值调至大于PKW-P Kb+1,使弱碱性有机化合物以分子形态存在,就可以进行柱上富集。
 
  Masafumi[10]对硝基安定及其代谢物用MEKC方法分离分析,分离只需25min,检测限达0.1~0.2μg/m l。
 
  吴惠芳[8]、郭冬萍[11]综述了巴比妥类药物采用M EKC方法进行分离分析,巴比妥类药物的Pka值在7.4~8.1之间,当溶剂pH值为6.5时,多数巴比妥类药物的柱效较高,峰高也有类似的变化趋势,这表明样品溶剂的pH值在6.5时富集效果最好。当用常规进样方法时,进样量不能大于4.5nl;当进样量增大到10.5nl时,分离度严重下降。采用柱上富集技术,可以加大进样量而不影响分离,进样量增大到10.5nl,分离未受影响,提高了检测灵敏度。
 
  4场增加进样
 
  场增加进样(F AI)[5]作为样品柱上浓缩技术的基本原理与电堆积富集相同,不过它是在电动进样过程中实现。由于样品物质仍溶解在稀释后的载体电解质溶液中,则电动进样时进样口端的电场强度大大高于毛细管内部。进样口端样品离子在高电场强度下迁移速度大大加快,样品负离子的迁移方向与电渗流的方向相反不能进入毛细管中,而样品正离子的迁移方向与电渗流的方向相同进入毛细管之后在低电场强度下放慢迁移速度,如此这样的结果导致样品正离子的柱上浓缩。FA I分柱上FAI和柱头FAI:柱上FAI由于毛细管柱中局部电渗流不同,引起层流,损失分离效率;柱头FAI是进样前,以流体动力进样法引入一小段水柱,加压后该区场强比电泳时高几百倍,使带电物质快速迁移入毛细管,在水柱和背景电解质交界处堆积,灵敏度提高1 000倍。柱头FAI是所有样品堆积技术中灵敏度提高最大且操作方便的一种技术。
 
  Zhang等采用柱头FAI分离检测血浆中痕量乙胺碘呋酮及其代谢物去乙基乙胺碘呋酮,检测限达70nm ol/L。临床样品测定结果与HPLC相符,而本法测定时间仅需10min,比HPLC更适用于快速临床测定。
 
  5在柱色谱预浓缩
 
  在柱色谱预浓缩采用了浓缩微反应室[13~15],该方法可浓缩较大体积样品中的痕量组分,并同时脱盐和提纯。根据微反应室中作用类型的不同,该法可分为非特异性在柱预浓缩和特异性在柱预浓缩。
 
  5.1非特异性在柱预浓缩
 
  浓缩微反应室中含有非特异性固体填料,两端固定多孔聚合物塞。样品中待测物键合到固体填料上,CE缓冲液洗脱除去基质和试剂,改变洗脱液,并以少量洗脱液使待测物解离,实现了样品的提纯和浓缩,然后恢复CE缓冲液,进行分析测定,该技术称为固相预浓缩-毛细管电泳(spP C-CE)。由于spPC-CE中填料和多孔塞具有阻碍作用,会改变物质迁移时间,采用涂布/浸渍膜代替填料和多孔塞,可避免上述问题,此技术称为膜预浓缩-毛细管电泳(mP C-CE)。mP C-CE常与MS联用,能提供更多的定性信息。Tom linson等[13]采用m PC-CE-M S分析病人服用小剂量强安定药氟哌啶醇后尿样中代谢物,进样10μl,用80nl甲醇洗脱膜上待测物,可测出氟哌啶醇及其3种代谢物。与常规C E相比,进样量大大增加。
 
  5.2特异性在柱预浓缩
 
  利用亲合色谱原理,将具有特异性的配体共价健合到微反应室中载体上,配体与相应生物大分子能特异地、可逆地相互作用,抗体常作为亲合配体,与样品中抗原结合,用少量洗脱液冲洗,使免疫复合物裂解,释放出抗原,从而实现抗原物质的提纯和浓缩。采用单克隆抗体,可获得所需的特异性和结合力,且洗脱温和,此方法称为免疫亲合毛细管电泳(I ACE)。IAC E用于治疗药物监测方面有广阔的应用前景,已有学者将该方法用于监测血清中地高辛[16],还用于甾体激素氢化可的松的内分泌失调诊断。
 
  6CE在体内药物分析中的应用展望
 
  目前,体内药物分析加药代研究、治疗药物监测、滥用药物测定等,主要应用HPLC,但采用H PLC时,样品预处理既费时又费力,平衡时间和分析时间较长,且耗用大量流动相。从发展趋势看,CE具有高效、价廉等优点,适于普及。通过对样品进行浓缩预处理,可提高检测灵敏度,其各分支技术的联用及同质谱等其它技术的联用,将会得到迅速发展,其检测限向超低限发展,应用范围将不断扩大,展示了其广阔的应用前景。
 
  参考文献:
 
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