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HPLC 法监测人血清中茶碱类药物浓度

2020-06-03 15:45 出处:未知 人气: 评论(0
  摘要:目的建立同时测定茶碱类药物血药浓度的高效液相色谱法。方法筛选得到的最佳色谱条件为:采用色谱柱Ultimate XB-C18柱(4.6×200mm,5μm),以咖啡因为内标,甲醇-乙腈-水(20∶3∶77)为流动相,流速1.0mL·min-1,检测波长273nm,柱温30℃。采用先沉淀后提取的方法进样测定。结果多索茶碱和茶碱分别在1.5~24mg·L-1(r=1.0000)和2.5~40mg·L-1(r=0.9996)范围内线性关系良好。多索茶碱的低、中、高浓度平均回收率为100.07±5.30%,日间精密度和日内精密度RSD均小于6.5%。茶碱的低、中、高浓度回收率为101.72±4.92%,日间精密度和日内精密度RSD均小于5.5%。结论该方法灵敏度高、准确、重复性好,适用于多索茶碱和茶碱血药浓度的测定。
 
  关键词:多索茶碱;茶碱;HPLC;血药浓度
 
  茶碱类药物具有舒张呼吸道平滑肌、强心、利尿、扩张冠状动脉和兴奋呼吸中枢等作用,低血药浓度(5~10mg·L-1)时也有一定的抗炎和免疫调节作用〔1〕,临床上应用广泛。然而茶碱类药物治疗窗窄,个体差异大。其中茶碱最佳血药浓度为6~15mg·L-1〔1〕;>20mg·L-1时容易发生毒性反应;>40mg·L-1时致发热、脱水、惊厥等,严重者致呼吸、心跳停止〔2〕。长期使用茶碱类药物或静脉注射速度过快,或联合使用其他影响茶碱代谢的药物等,均可导致茶碱中毒。甚至有些患者在用药过程中出现胸闷、气促、心悸、心跳加快等不适时,仍没有意识到茶碱的毒性反应,反认为是茶碱剂量不足致疾病未控好,从而增加剂量,结果导致更严重的后果发生。因此,对茶碱类药物进行血药浓度监测越发显得重要了。我院常用的茶碱类制剂有多索茶碱注射液和茶碱缓释片。国内外关于这2种药的监测方法已有很多报道〔3~5〕。本文通过对多索茶碱和茶碱的血药浓度监测方法进行优化和改良,建立分离效果好、简便可行的高效液相色谱测定条件,确保临床用药安全、有效。
 
  1材料
 
  1.1仪器与试药
 
  1.1仪器Waters高效液相色谱系统(美国waters公司),包括515泵,Waters 2487双波长检测器,Millenium32色谱管理系统;80-2离心机;TGL-16C超高速心机;XW-80A旋涡混合器;光学读数分析天平。
 
  2方法与结果
 
  1.2试药茶碱对照品(中国药品生物制品检定所,批号199903);多索茶碱(山东瑞阳制药有限公司,批号100601,纯度99.5%);咖啡因对照品(中国食品药品检定研究院,批号171215-201211);甲醇为色谱醇、二氯甲烷为分析纯、水为过滤重蒸馏水。
  A.空白血清+咖啡因;B.空白血清+多索茶碱对照品+茶碱对照品+内标;1.咖啡因2.茶碱3.多索茶碱
 
  2方法与结果
 
  2.1色谱条件色谱柱:Ultimate XB-C18柱(4.6×200mm,5μm);流动相:甲醇-乙腈-水(20∶3∶77);流速:1.0mL·min-1;检测波长:273nm;柱温:30℃;内标:咖啡因。
 
  2.2溶液的配制①茶碱储备液:精密称取茶碱对照品
 
  0.02040g,置10mL棕色容量瓶中,加甲醇溶解并定容,配成2040mg·L-1母液。再用移液器量取1mL茶碱母液于10mL容量瓶中,用甲醇定容,配成204mg·L-1茶碱储备液。②多索茶碱储备液:精密称取多索茶碱对照品0.01970g,置10mL棕色容量瓶中,加甲醇溶解并定容,配成1970mg·L-1母液。再用移液器量取1mL多索茶碱母液于10mL容量瓶中,用甲醇定容,配成197mg·L-1多索茶碱储备液。③咖啡因溶液:精密称取咖啡因对照品0.00150g,置10mL棕色容量瓶中,加甲醇溶解并定容,配成150mg·L-1内标溶液,置冰箱中备用。
 
  2.3血样处理取血清100μL于具塞尖底离心管中,加入内标溶液20μL,混匀后加入甲醇400μL,混匀,加入二氯甲烷2mL,旋涡混合1min,4000r·min-1离心15min,吸取下清液1mL于45℃氮气流下吹干,残渣用200μL甲醇复溶后进样分析。
 
  2.4专属性考察(见图1)。
 
  2.5线性关系考察精密吸取血清100μL于尖底具塞离心管中,分别加入20μL内标、多索茶碱标准溶液(120,60,30,15,7.5mg·L-1)和茶碱标准溶液(200,100,50,25,12.5mg·L-1),配成含多索茶碱/茶碱浓度为(24/40,12/20,6/10,3/5,1.5/2.5mg·L-1),以下按“2.3”项下操作。以浓度(C)对样品和内标峰面积(A)进行线性回归,得标准曲线方程分别为:多索茶碱:A=0.0039C-0.0083,r=1,线性范围为1.5~24mg·L-1。茶碱:A=0.0070C+0.0155,r=0.9996,线性范围为2.5~40mg·L-1。
 
  2.6回收率试验分别配制多索茶碱/茶碱浓度为(1.5/2.5,6/10,24/40mg·L-1)低、中、高3种浓度的质控样品,按“2.3”项下操作,分别于当日重复测定5次和连续5d内测定,以实测浓度与加入浓度之比的计算方法计算回收率、日内精密度和日间精密度(见表1)(n=5)。
  2.7最低检测限当信躁比(S/N)=3时,茶碱与多索茶碱的最低检测限均可达到0.5mg·L-1。
 
  3讨论
 
  3.1流动相的选择文献〔5〕采用含磷酸二氢盐缓冲溶液的流动相,以期达到更好的分离目的。但含盐流动相对色谱柱及压力泵损害较大,长期使用,又未能冲洗干净,会缩短仪器的使用寿命。因此,本实验最初参考文献〔4,6~8〕,在固定其他实验条件的前提下,依次选择以下流动相进行分析:①甲醇-水(22∶78),②甲醇-水(25∶75),③甲醇-水(30∶70),④甲醇-水(35∶65),但分离结果均不理想。如采用甲醇-水(22∶78),茶碱保留时间(retention time,RT)为7.023min,多索茶碱RT为16.382min,洗脱时间太长;甲醇-水(30∶70),茶碱RT为4.000min,多索茶碱RT为7.423min,但茶碱有干扰峰;甲醇-水(35∶65),茶碱RT为2.365min,多索茶碱RT为4.023min,干扰峰多。参考反相HPLC的溶剂强度计算图〔9〕,使用甲醇-乙腈-水(20∶3∶77)作流动相,结果咖啡因、茶碱和多索茶碱的保留时间分别为6.207min,9.223min和13.998min,分离度均>1.5,且峰形好。故本实验使用甲醇-乙腈-水(20∶3∶77)作流动相。
 
  3.2血样处理方法的选择文献关于血样处理的方法有沉淀法和萃取法〔4,5,8〕。本文采用先沉淀后提取的方法处理血清样品,原因如下:首先,多索茶碱和茶碱的血浆蛋白结合率低,对回收率影响小,可以使用沉淀法。其次,用蛋白沉淀法不仅能够有效去除蛋白,减少杂质峰对样品峰的干扰,而且不容易堵柱,延长色谱柱的使用寿命。甲醇作沉淀剂的理由是:在每容积血浆中加入4倍体积的甲醇时,蛋白沉淀率达99.2%〔10〕。且甲醇与水互溶,沸点低,有利于下一步的提取和吹干〔10〕。第三,提取法的优点为有效成份溶解度大,杂质溶解度小。二氯甲烷作提取剂的理由:①二氯甲烷毒性相对低,安全性大,与空气混合不爆炸。②虽然因二氯甲烷的相对密度大,在水层下面,但可以使用移液管吸取二氯甲烷提取物来克服。③二氯甲烷沸点低〔10〕,在40℃下很快被氮气吹干,缩短操作时间。因此,本文采用先沉淀后提取的方法,既能提高回收率,又能减少血清杂质的干扰,延长色谱柱和泵的使用寿命。
 
  3.3流速的选择本实验在其他色谱条件不变的前提下,记录了流速在1.0~1.2mL·min-1范围内的色谱图,结果显示:流速在1.0mL·min-1时,各峰的分离度和对称性最佳。而使用流速1.1mL·min-1和1.2mL·min-1时,有干扰峰,影响分离。因此,最佳流速为1.0mL·min-1。总而言之,使用本法测定茶碱类药物血药浓更加准确、灵敏,值得推广。
 
  参考文献
 
  〔1〕叶伶,金美玲.茶碱类药物的研究进展及其临床应用〔J〕.世界临床药物,2009,30(1):23.
 
  〔2〕卫生部合理用药专家委员会编.《中国医师药师临床用药指南》〔M〕.第1版.重庆:重庆出版集团,2009,668。
 
  〔3〕唐富山,佟婉红,牟希恒.反相高效液相色谱法同时测定血清中多索茶碱和茶碱的浓度〔J〕.甘肃医药,2011,30(9):517.
 
  〔4〕朱金平,林秀丽,陈春枚,费燕.互为内标法测定人血清中茶碱与多索茶碱的浓度〔J〕.海峡药学,2011,23(6):243.
 
  〔5〕孔秋芹,杨水新.茶碱类药物的血药浓度监测方法与应用〔J〕.福建医药杂志,2005,27(6):149.
 
  〔6〕马金秋,王娜,王莉,等.RP-HPLC法测定人血清中茶碱与多索茶碱的浓度〔J〕.中国药房,2010,21(18):1665.
 
  〔7〕陈锦珊,杜青云,黄惠丽,等.反相高效液相色谱法测定人血清中多索茶碱浓度〔J〕.海峡药学,2003,15(4):28.
 
  〔8〕张峻,姚勤,周琼,吴晖.RP-HPLC法同时测定人血浆中茶碱和多索茶碱的浓度〔J〕.中国药房,2010,21(42):3974.
 
  〔9〕森德尔.实用高效液相色谱法的建立〔M〕.北京:华文出版社,2001:253.
 
  〔10〕姚彤炜.体内药物分析〔M〕.杭州:浙江大学出版社,2004:49.
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