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建立测定兔眼角膜中盐酸特比萘芬含量的甲醇浸提-HPLC法

2020-06-03 15:29 出处:未知 人气: 评论(0
  摘要目的:建立测定兔眼角膜中盐酸特比萘芬含量的方法。方法:取日本大耳白兔18只,随机分为6组,每组3只,双眼给予0.2%盐酸特比萘芬滴眼液50μl。分别于给药后15、30、60、120、240、480 min时处死兔,剖取角膜,加入甲醇,充氮气,密封冷藏静置浸泡24 h后,涡旋,离心,取上清液采用高效液相色谱法测定其中盐酸特比萘芬的含量。色谱柱为Waters X-Bridge C18,流动相为甲醇-水(92∶8),流速为0.7 ml/min,检测波长为224 nm,柱温为40℃,进样量为20μl。结果:在兔眼角膜醇浸提液中盐酸特比萘芬检测质量浓度在0.007 64~0.382μg/ml(r=0.999 8,n=6)范围内与峰面积呈良好的线性关系;方法回收率为99.6%(RSD=4.5%,n=3),提取回收率为98.5%~103.2%(RSD=6.8%~11.0%,n=3);日内RSD为4.1%(n=5),日间RSD为4.5%(n=5)。给药480 min后仍可测得盐酸特比萘芬,其质量浓度为(0.102±0.043 3)μg/ml。结论:本方法专属性强、准确度高,可用于兔眼角膜中盐酸特比萘芬的含量测定。
 
  关键词盐酸特比萘芬;兔;角膜;甲醇浸提;高效液相色谱法
 
  盐酸特比萘芬(Terbinafine hydrochloride,TH)属于丙烯胺类抗真菌药,主要通过抑制角鲨烯环氧化酶而发挥强大的抑菌和杀菌作用[1-2]。近年来的研究发现,TH对大部分眼部感染真菌有很高的敏感性,其在真菌性角膜炎治疗中的研究和应用越来越广泛[3-6]。角膜组织中TH的吸收和分布是治疗真菌性角膜炎的关键,但角膜组织中TH的测定方法[7-8]报道较少。此外,TH分子结构中含共轭键的烯炔基团容易被氧化,在样品处理时应注意防止TH的氧化。因此,笔者在文献的基础上对测定方法进行了改进和简化,采用了更简单的具有保护性的处理方法,且可检测角膜中更低浓度水平的TH。本方法特异性强、灵敏度高、重现性好,可用于兔眼角膜中TH的含量测定,现报道如下。
 
  1材料
 
  1.1仪器
 
  2695型高效液相色谱(HPLC)系统,包括2695分离单元、2487检测器、Empower2色谱工作站(美国Waters公司);Met-tler AB135-S型电子天平(瑞士Mettler Toledo公司);LD5-2A型离心机(北京医用离心机厂,离心半径:15 cm)
 
  1.2药品与试剂
 
  TH对照品(山东铂源药业有限公司,批号:130703TH,纯度:99.55%);0.2%TH滴眼液(W/V,蓖麻油溶液,河南省眼科研究所自制,批号:131201,规格:5 ml∶10 mg);甲醇(HPLC级,美国Tedia公司,批号:13075031);其他试剂均为分析纯。
 
  1.3动物
 
  日本大耳白兔18只,健康无眼疾,♂,体质量2.2~2.6 kg,购自河南康达实验动物有限公司,实验动物使用合格证号为SCXK(豫)2011-0001,动物房温度为(25±2)℃,自由进食饮水。本研究动物实验经郑州大学生命科学伦理审查委员会和河南省立眼科医院生命科学伦理审查委员会批准实施。
 
  2方法与结果
 
  2.1样品的处理
 
  取兔眼角膜,剪碎,加入甲醇0.5 ml,充入氮气,封口膜密封,2~8℃避光冷藏24 h。取出冷藏样品,涡旋振荡1 min,以离心半径15 cm、3 500 r/min离心8 min,取上清液进行测定。
 
  2.2色谱条件
 
  色谱柱:Waters X-Bridge C1(8 150 mm×3.0 mm,3.5μm);
 
  流动相:甲醇-水(92∶8,V/V),流速:0.7 ml/min;柱温:40℃;进样量:20μl;检测波长:224 nm。
 
  2.3专属性考察
 
  在“2.2”项色谱条件下,按“2.1”项下方法进行处理测定,空白角膜浸提液、空白角膜浸提液+TH对照品(0.191µg/ml)和给药后15 min角膜样品浸提液的色谱显示,TH的保留时间为2.46 min左右,TH峰形良好,空白角膜浸提液对测定无干扰。色谱图见图1。
  A.空白角膜;B.空白角膜+TH对照品;C.角膜样品;1.TH
 
  Fig 1 HPLC chromatograms
 
  A.blank cornea;B.blank cornea+TH control;C.cornea sample;1.TH
 
  2.4线性回归考察
 
  精密称取低温真空干燥的TH对照品0.011 98 g,置于50 ml量瓶中,加入甲醇至刻度,振摇溶解均匀,得质量浓度为239µg/ml的TH贮备液。取上述贮备液适量,依次稀释制成质量浓度分别为3.82、1.91、0.764、0.382、0.153、0.076 4µg/ml的标准液。精密吸取各标准液10μl,置于试管中,加入空白角膜浸提液90μl,混匀得质量浓度相当于0.382、0.191、0.076 4、0.038 2、0.015 3、0.007 64µg/ml的工作液,进样测定,记录峰面积。以TH的质量浓度(c)为横坐标、TH的色谱峰面积(A)为纵坐标,进行线性回归分析。得TH的回归方程为c=A×2.551×10-6+1.720×10-(4 r=0.999 8,n=6)。结果表明,TH检测质量浓度的线性范围为0.007 64~0.382µg/ml,检测限为0.002 55μg/ml。
 
  2.5方法回收率与精密度试验
 
  取质量浓度分别1.910、0.764、0.153µg/ml的标准液各10μl,分别加入空白角膜浸提液90μl,制备成质量浓度分别相当于0.191 0、0.076 4、0.015 3µg/ml的质控样品,进样测定,记录峰面积。以实测值与理论值之比计算方法回收率。同日内测定5次考察日内精密度,连续测定5 d考察日间精密度。结果表明,平均方法回收率为99.6%,RSD为4.5%(n=3);平均日内RSD为4.1%(n=5),平均日间RSD为4.5%(n=5),结果见表1。
  2.6提取回收率试验
 
  取质量浓度分别1.910、0.764、0.153µg/ml的标准液各10μl,分别加入甲醇90μl,混匀,加入剪碎的空白角膜约0.015 g,轻微振荡使角膜组织分散均匀,密封,参照“2.1”项下方法处理后制备提取回收率样品(ES),每个质量浓度平行制备3份。
 
  另取相应质量浓度的标准液各10μl,加入甲醇90μl,混匀,即得质量浓度分别相当于0.191 0、0.076 4、0.015 3µg/ml的对照样品(EC),每个质量浓度平行制备3份。进样测定,记录峰面积(A),以AES×1.15/A平均EC×100%计算提取回收率。结果,平均提取回收率为101.02%,RSD为8.73%(n=3),见表2。
  2.7浸提效率的考察
 
  取兔3只,双眼各给予0.2%TH滴眼液50μl,30 min后处死,取角膜,按照“2.1”项下方法处理,分别于甲醇中浸泡24、48、72 h后各取样50μl,以离心半径15 cm、3 500 r/min离心8 min,取上清液进样测定,结果见表3。
  对比各时间点样品测定的峰面积(配对t检验),评价浸提效率。24 h测定的峰面积与48 h比较P=0.865(n=6),与72 h比较P=0.510(n=6),即差异均无统计学意义,表明样品经过甲醇浸泡24 h,TH即可提取完全。
 
  2.8稳定性考察
 
  取“2.5”项下制备的质量浓度分别相当于0.191 0、0.076 4、0.015 3µg/ml的质控样品,2~8℃下避光冷藏4周,分别于24、48、72 h及4周取样,进样测定,每个质量浓度、每个时间点平行测定3份,计算回收率。结果,各时间点的回收率与0时比较差异均无统计学意义(P>0.05,n=3),见表4。
  2.9药动学实验
 
  取兔18只,随机分为6个时间组,每组3只,双眼各给予临床常用剂量(50μl)的0.2%TH滴眼液,分别于给药后15、30、60、120、240、480 min处死各时间组兔。生理盐水冲洗眼表(每眼10 ml),蘸去水分,剖取角膜,再用生理盐水冲洗眼表(每眼5 ml),滤纸吸去附着水分,精密称质量(m角膜),-70℃冷冻保存备用。按“2.1”项下方法对角膜样品进行处理,取上清液进样测定,记录峰面积,代入回归方程计算角膜浸提液中的药物浓度(c角膜浸提液),按照公式计算角膜样品中的药物浓度(c角膜),c角膜=c角膜浸提液×(0.5+m角膜)/m角膜。结果0.2%TH滴眼液滴眼给药480 min后兔眼角膜中仍可测得TH,见表5。
  3讨论
 
  TH在眼部的研究和应用多集中于治疗真菌性角膜炎,而角膜中TH的药动学研究涉及很少,仅少量文献[7-8]进行过简单的报道。其他研究者多以房水中TH浓度来评价其眼部药动学[4-6],这显然不能全面反映TH在眼部的吸收情况。笔者在文献的基础上对角膜中样品的处理方法进行了改进,采用简单的甲醇静置浸泡法处理样品,无需进行超声和加热处理;同时在样品管内充入氮气,防止TH在处理过程中氧化。经验证,只需0.5 ml甲醇冷藏(2~8℃)静置浸提24 h即可完全提取兔眼角膜中的TH,最大限度地保证了浸提液中的药物浓度水平;如果甲醇量过少则会导致无法完全浸没角膜组织。在氮气的保护下,浸提液中的TH在4周内稳定,完全可满足测定的要求。值得注意的是,甲醇浸提液也无需进行再次的处理,离心后上清液即可直接进样分析,干扰少、测定效率高、重现性好。
 
  本研究建立的测定兔眼角膜中TH浓度的醇浸提-HPLC方法专属性强、准确度高,充分保证了测定方法的灵敏度和重现性,能够方便准确地测定兔眼角膜中的TH浓度,可用于TH兔眼角膜的药动学研究。
 
  参考文献
 
  [1]Nowosielski M,Hoffman M,Wyrwicz LS,et al.Detail-ed mechanism of squalene epoxidase inhibition by terbin-afine[J].J Chem Info Model,2011,51(2):455.
 
  [2]逄晓云,贡沁燕.抗真菌新药:特比萘芬[J].中国新药与临床杂志,2000,19(7):1.
 
  [3]Li L,Wang ZQ,Li R,et al.In vitro evaluation of combi-nation antifungal activity against fusarium species isolatedfrom ocular tissues of keratomycosis patients[J].Ameri-can Journal of Ophthalmology,2008,146(5):724.
 
  [4]Clode A,Davis J,Davidson G,et al.Aqueous humor andplasma concentrations of a compounded 0.2%solution of terbinafine following topical ocular administration to nor-mal equine eyes[J].Vet Ophthalmol,2011,14(1):41.
 
  [5]Tayel SA,El-Nabarawi MA,Tadros MI,et al.Promisingion-sensitive in situ ocular nanoemulsion gels of terbin-afine hydrochloride:design,in vitro characterization and in vivo estimation of the ocular irritation and drug pharma-cokinetics in the aqueous humor of rabbits[J].Int JPharm,2013,443(1/2):293.
 
  [6]Tayel SA,El-Nabarawi MA,Tadros MI,et al.Positively charged polymeric nanoparticle reservoirs of terbinafine hydrochloride:preclinical implications for controlleddrug delivery in the aqueous humor of rabbits[J].AAPSPharmSciTech,2013,14(2):782.
 
  [7]Sun XG,Wang ZX,Wang ZQ,et al.Pharmacokinetics of terbinafine in the rabbit ocular tissues after topical ad-ministration[J].Ophthalmic Res,2007,39(2):81.
 
  [8]孙旭光,王智群,李然,等.抗真菌药特比萘芬对兔眼药代动力学的实验研究[J].眼科,2002,11(4):235.
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