内容字号:默认大号超大号

段落设置:段首缩进取消段首缩进

字体设置:切换到微软雅黑切换到宋体

HPLC 测定荷瘤小鼠皮下微透析液中乳酸含量

2020-05-28 09:30 出处:未知 人气: 评论(0
  [摘要]目的:建立微透析联合HPLC测定荷瘤小鼠皮下微透析液中乳酸含量的方法。方法:采用微透析系统收集正常小鼠和H22荷瘤小鼠皮下微透析液,利用HPLC测定小鼠皮下微透析液中乳酸的含量。ZORBAX SB-Aq色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相甲醇-0.1%磷酸溶液(5∶95),流速1.0 mL·min-1,检测波长210 nm柱温30℃。结果:线性范围20.39~611.6 mg·L-1。平均回收率97.41%,RSD 4.6%。结论:该方法能够准确检测出透析液中乳酸的含量,具有简单可靠、分析速度快、灵敏度高、精密度好等优点,为乳酸的检测提供新途径。
 
  [关键词]乳酸;微透析;高效液相色谱法;H22荷瘤小鼠
 
  肿瘤是一种能量代谢性疾病[1],在有氧条件下,肿瘤细胞主要通过葡萄糖酵解供能,提高了对葡萄糖的摄取和乳酸的生成,且肿瘤的恶性程度越高,糖酵解增强的趋势就越明显。前期研究发现乳酸是肿瘤组织的主要能源物质之一。大量研究报道中医药具有抑制肿瘤细胞糖酵解的作用[2-3],其中简便、快捷、动态观察整体动物能量代谢的变化是一项关键技术。Sonveaux等[4]研究发现离血管较远的缺氧肿瘤细胞更具侵蚀性、对化疗更耐受的原因可能与乳酸的利用有关,故准确测定机体中乳酸的含量对于检测患者能量代谢情况、判断疾病的严重程度和客观判断预后均具有重要临床意义[5]。测定乳酸的方法有滴定法、酶法[6]、气相色谱法[7]和高效液相色谱法(HPLC)[8-10],其中HPLC可直接进样分析,具有快速、精确、检测浓度范围宽等优势。但采用HPLC对生物样本的处理过程比较复杂,故采用微透析法避免对样本进行复杂处理。微透析是一种实时连续活体采样技术,微透析液可直接用于HPLC进样分析,实现了内源性物质和体内药物的实时测定,可有效缩短取样时间,提高样品的稳定性,并能节省时间及成本,是体内药物分析的重大突破[11-12]。本实验联合微透析和HPLC,成功建立了HPLC检测荷瘤小鼠皮下透析液中乳酸含量的方法,具有快速、准确、重复性好等特点。
 
  1材料
 
  1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司),MS205DU型1/10万电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司),CMA4004型微透析采血系统(台湾CMA公司),A10 Milli-Q型纯水仪(法国默克密理博公司),EVC型小鼠饲养笼系统(苏州猴皇动物实验设备科技有限公司)。透析膜(10 mm,台湾CMA公司),乳酸对照品(美国Supelco公司,批号LC01198V,纯度99.9%),戊巴比妥钠(德国Merck公司),生理盐水(浙江国镜药业有限公司,批号C114091607),甲醇为色谱纯,水为自制纯水,其他试剂均为分析纯。
 
  雄性昆明种SPF级小鼠20只,体重20~22 g,购自中国食品药品检定研究院,合格证号SCXK(京)2009-0017,25℃自由饮食,于中央排气通风笼盒系统环境饲养。H22荷瘤种(中药固体制剂制造技术国家工程研究中心药理学科组)。
 
  2方法与结果
 
  2.1色谱条件ZORBAX SB-Aq色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相甲醇-0.1%磷酸溶液(5∶95),流速1.0 mL·min-1,检测波长210 nm,进样量20μL。
 
  2.2溶液的配制
 
  2.2.1对照品溶液精密称取乳酸对照品3.67 mg,用水定容至6 mL,即得。
 
  2.2.2供试品溶液将作为透析液的生理盐水于0.22μm微孔滤膜进行过滤,分装备用。分别取正常昆明种小鼠和H22荷瘤模型小鼠各4只,按0.01 mL·g-1给予0.1%戊巴比妥钠进行麻醉,待完全麻醉后,剪去穿刺部位鼠毛,采用CMA30型线性微透析探针穿过腹部皮下,经微透析系统按4μL·min-1流速推注前述过滤后的生理盐水[11-13],10 min后开始收集,每只小鼠收集透析液240μL。分别将各组收集到的透析液充分混匀后分装(混合供试品),每管60μL,得到正常昆明鼠透析液供试品和H22荷瘤小鼠透析液供试品,于4℃保存备用。
 
  2.3 H22荷瘤小鼠模型的建立取H22荷瘤小鼠将其颈椎脱臼处死,在75%乙醇中浸泡1~2 min后抽取其腹水,用生理盐水稀释腹水并吹打混匀,于1 000 r·min-1离心5~8 min,弃去上清液,加生理盐水吹打混匀进行稀释,计数配成1×107个/mL的瘤细胞悬液,移入50 mL无菌离心管中,置于冰水浴中备用,按0.2 mL/只小鼠右腋窝皮下接种。在接种后1周正常饲养,瘤体大小>15 mm×12 mm,用于微透析系统透析收集微透析液。
 
  2.4方法学考察
 
  2.4.1专属性试验按2.1项下色谱条件检测乳酸对照品、微透析液中乳酸含量,在相应保留时间处均有乳酸的色谱峰,见图1。因无法清除微透析液中的乳酸,故未设阴性样品。
  2.4.2线性关系考察精密吸取乳酸对照品溶液,稀释成10个不同质量浓度(611.6,458.7,407.7,305.8,203.86,152.9,122.5,61.16,30.5,20.39 mg·L-1),摇匀,按2.1项下条件测定(n=4),以进样量为横坐标,峰面积平均值为纵坐标,得回归方程Y=32.92X+5.541(r=0.999),微透析液中乳酸质量浓度在20.39~611.6 mg·L-1与峰面积的线性关系良好。最低检测下限20.39 mg·L-1。
 
  2.4.3精密度试验精密吸取61.16 mg·L-1乳酸对照品溶液,按2.1项下条件重复进样6次,计算乳酸峰面积的RSD 1.4%,表明仪器精密度良好。
 
  2.4.4重复性试验分别取2.2.2项下同一混合供试品溶液6份,按2.1项下条件测定,结果乳酸平均质量浓度26.52 mg·L-1,RSD 3.9%,表明本方法重复性良好。
 
  2.4.5稳定性试验取对照品溶液分别于0,12,24,48,72,96 h和混合供试品溶液分别于0,24,48,96 h按2.1项下条件测定,计算对照品溶液中乳酸峰面积的RSD 1.3%,混合供试品溶液中乳酸峰面积的RSD 2.3%,表明供试品溶液和对照品溶液均在96 h内稳定性良好。
 
  2.4.6加样回收试验取2.2.2项下混合供试品6份,每份60μL,各精密加入等体积305.8 mg·L-1乳酸对照品溶液,混匀,按2.1项下条件测定,计算微透析液中乳酸的平均回收率97.41%,RSD5.0%,表明本方法符合含量测定的要求。

        2.4.7模型组与正常组透析液中乳酸含量的比较分别取2.2.2项下H22荷瘤小鼠模型组透析液和正常组透析液,按2.1项下色谱条件测定,计算二者中透析液乳酸质量分别为含量为1.131,0.532μg,乳酸含量H22荷瘤模型组明显高于正常组,且存在显著性差异(P<0.05)。
 
  3讨论
 
  体液中乳酸的水平能够反映机体能量代谢的状态,HPLC是测定乳酸的常用方法之一,但该方法的样本前处理过程过于复杂,不利于实时检测,本文采用微透析法联合HPLC可有效提高检测效率和检测结果的稳定性。本文采用微透析联合HPLC检测透析液中乳酸的含量,实现了在体、动态、实时监测机体能量代谢变化状态,对于临床和实验研究均有一定实用价值。
 
  预试验对色谱柱和流动相进行了考察,根据乳酸理化特性,考虑到其性质和流动相中水相比较大,比较了ZORBAX SB-C18和ZORBAX SB-Aq色谱柱对乳酸的分析能力,结果发现ZORBAX SB-C18色谱柱的分离度较差,乳酸和溶剂分不开,理论塔板数不符合要求;而ZORBAX SB-Aq色谱柱不仅分离效果较好,且不出现肩峰等,故确定使用ZORBAX SB-Aq色谱柱测定微透析液中乳酸的含量。流动相考察了220 mmol·L-1磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液(pH 6.7,含6 mmol·L-1四丁基氢氧化铵[8])、甲醇-0.1%磷酸水溶液(5∶95)[9]和0.1 mol·L-1磷酸二氢钾-磷酸(pH2.5)[14]等,结果显示在甲醇-0.1%磷酸水溶液系统下,样品中乳酸的分离度较好;同时在此流动相下考察了不同配比,结果表明选择甲醇-0.1%磷酸水溶液(5∶95)时,其峰形和分离度为最好。
 
  [参考文献]
 
  [1]Seyfried T N,Shelton L M.Cancer as a metabolic disease[J].Nutr Metab(Lond),2010,7(7):2-22.
 
  [2]白晶,徐力.中医药对癌症恶病质的治疗分析[J].中医学报,2010,25(2):216-218.
 
  [3]张永军,马胜林,张爱琴.中医药防治肿瘤恶病质的作用[J].实用肿瘤学杂志,2008,22(4):373-375,384.
 
  [4]Sonveaux P,Végran F,Schroeder T,et al.Targeting lactate-fueled respiration selectively kills hypoxic tumor cells in mice[J].J Clin Invest,2008,118(12):3930-3942.
 
  [5]Warren D E,Jackson D C.Lactate metabolism in anoxicturtles:an integrative review[J].J Comp Physiol B,2008,178(2):133-148.
 
  [6]柳畅先,庹浔,吴士筠.酶法测定乳酸[J].分析试验室,2005,24(9):75-77.
 
  [7]刘师莲,祁维平,秦延江,等.气相色谱法测定线粒体脑肌病患者血清和脑脊液中的乳酸[J].色谱,2003,21(5):480-482.
 
  [8]汤丽芬,吴珏珩,张选红,等.高效液相色谱法同时测定小鼠脑组织中乳酸与磷酸肌酸含量[J].中国卫生检验杂志,2005,15(3):300-301,303.
 
  [9]董秀丽.高效液相色谱法测定小鼠血清中的乳酸[J].光谱实验室,2012,29(5):2937-2939.
 
  [10]McHughet J,Dumont S N,Paradis J,et al.New and simple HPLC method for the determination of lactic acid content in ciprofloxacin injection[J].J Liq ChromatogrRT,2006,29(13):1905-1916.
 
  [11]Nandi P,Lunte S M.Recent trends in microdialysis sampling integrated with conventional and microanalytical systems for monitoring biological events:A review[J].Anal Chim Acta,2009,651(1):1-14.
 
  [12]聂颖兰,范斌,闫寒,等.微透析与现代分析技术在线联用的研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(5):252-255.
 
  [13]张群林,张云静,吴亮,等.微透析-液相色谱-化学发光法测定大鼠脑组织中丹参酚类化合物浓度及其药代动力学研究[J].中国药理学通报,2010,26(9):1230-1237.
 
  [14]刘国英,许世荣.关于提高HPLC法测定乳酸准确性的探讨[J].酿酒,2008,35(19):47-48.
分享给小伙伴们:
本文标签:

相关文章

评论

发表评论愿您的每句评论,都能给大家的生活添色彩,带来共鸣,带来思索,带来快乐。

签名: 验证码: 点击我更换图片

评论列表

    Copyright © 2020 医药论文投稿_药学论文网 版权所有