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柱前衍生HPLC法测定大鼠血浆中的河蚌糖胺聚糖

2020-05-20 09:11 出处:未知 人气: 评论(0
  摘要目的:建立柱前衍生高效液相色谱法(HPLC)用于河蚌糖胺聚糖在大鼠血浆中的含量测定。方法:使用异硫氰酸荧光素(FITC)对河蚌糖胺聚糖进行荧光标记,色谱柱为Shodex SB-804HQ(8.0×300 mm),流动相为流速为0.5 mL·min-1的0.1 mol·L-1的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液(pH 7.8),柱温30℃,激发波长495 nm,发射波长520 nm。结果:FITC对河蚌糖胺聚糖的荧光标记率为70;线性范围为5~120μg·mL-1,批内和批间精密度均小于15.0%,提取回收率为51.5~58.6%,样品在血浆中稳定性良好。结论:血浆中内源性杂质不干扰样品的测定,建立的方法符合生物样本的分析要求。
 
  关键词:河蚌糖胺聚糖;柱前衍生高效液相色谱法;异硫氰酸荧光素;荧光检测器
 
  前言
 
  河蚌是一种药食两用的中药材,功能清热消炎,现代研究表明其主要起效成分为河蚌糖胺聚糖,其对心血管系统、抗肿瘤和抗炎等方面作用显著[1-3]。
 
  河蚌糖胺聚糖主要为酸性粘多糖,其中主要成分由葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖和氨基葡萄糖组成的糖胺聚糖[4,5],分离得到主要成分为重均分子量10万左右的均一多糖[6-8]。本研究建立荧光标记河蚌糖胺聚糖的高效液相色谱法,用于研究其在大鼠体内的代谢行为和规律。
 
  1材料与方法
 
  1.1实验材料
 
  1.1.1仪器Agilent 1200高效液相色谱仪,含四元泵、自动进样器、柱温箱、FLD检测器和Agilent ChemStation色谱工作站
 
  (美国安捷伦公司);F-4500荧光分光光度计(日本日立公司);XP 205分析天平(0.01 mg,梅特勒-托利多仪器有限公司);FA2104N分析天平(0.1 mg,上海精密科学仪器有限公司);HWS-26型电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司);CR7型冷冻离心机(日本日立公司);VX-200型涡旋混合器(美国莱伯特公司);Milli-Q型超纯水制备仪(密理博中国有限公司)。
 
  1.1.2试药河蚌糖胺聚糖(批号:20120118,重均分子量为98100的均一多糖,上海齐天生物医药有限公司);异硫氰酸荧光素(批号:1000759259,Sigma公司);磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸铵、氢氧化钠(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);无水乙醇(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);水(自制超纯水)。
 
  1.1.3实验动物SD大鼠:雄性,(250±50)g,上海中医药大学动物实验中心提供。
 
  1.2实验方法
 
  1.2.1多糖的FITC荧光标记及稳定性考察[9,10]取河蚌糖胺聚糖0.2 g于具塞试管中,加入2 mL的0.05 mol·L-1的NaOH水溶液,加塞密封,涡旋使多糖溶解。精密加入FITC 0.04 g,加塞密封,旋涡混合器混匀,放入95℃水浴中恒温反应45 min后,取出,冷却至室温,加入18 mL氯化钠饱和无水乙醇,离心弃去上清液,所得沉淀即为FITC荧光标记的河蚌糖胺聚糖粗品。向沉淀中加入20 mL氯化钠饱和无水乙醇,涡旋使标记多糖沉淀均匀分散于氯化钠饱和无水乙醇中,离心弃上层醇洗液,即为一次醇洗。经如此反复醇洗6次后,将沉淀冷冻干燥即得河蚌糖胺聚糖-FITC荧光标记物。
 
  荧光分光光度法测定标记率为70[9(]1 mol河蚌糖胺聚糖可连接70 mol FITC分子)。配制浓度为1.025 mg·mL-1的标准品溶液并经过30天冷冻考察,河蚌糖胺聚糖-FITC荧光标记物的含量下降6.8%,表明其在-20℃条件下保存1月样品稳定性良好,结果见图1。
  1.2.2色谱条件[9]色谱柱:Shodex SB 804高效凝胶色谱柱
 
  (8.0×300 mm),日本Shodex公司;流动相:0.1 mol·L-1的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液(pH 7.8),流速0.5 mL·min-1;荧光检测波长:激发波长495 nm,发射波长520 nm;柱温:30℃;进样量:50μL。
 
  1.2.3对照品溶液的制备取河蚌糖胺聚糖-FITC荧光标记物,精密称定,以0.1 mol·L-1的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液10 mL溶解,得到浓度为20.05 mg·mL-1对照品溶液。
 
  1.2.4血浆样品预处理精密吸取大鼠血浆样品200μL,置2 mL离心管中,加入饱和硫酸铵溶液400μL,旋涡3 min,于18000 r·min-1离心5 min。吸取上清液转移至自动进样器样品管中,进行HPLC分析,进样量50μL。
 
  2结果
 
  2.1方法学考察结果
 
  2.1.1专属性试验取五份不同来源的空白大鼠血浆样品,按照"1.2.4血浆样品预处理"项下处理,测定。结果显示,在本条件下,河蚌糖胺聚糖-FITC荧光标记物出峰时间在14.9 min左右。河蚌糖胺聚糖-FITC荧光标记物峰形良好,无杂峰干扰测定(见图2)。本方法特异性好,灵敏度高。
 
  2.1.2标准曲线的制备取河蚌糖胺聚糖-FITC荧光标记物标准液分别加入大鼠空白血浆200μL,制成浓度分别为2、5、10、20、40、60和120μg·mL-1的标准含药血浆,按照"1.2.4血浆样品预处理"项下操作,进样分析。以河蚌糖胺聚糖-FITC荧光标记物的峰面积A对血药浓度C作权重回归曲线,得权重回归方程为A=1.686+1.183×C(r=0.9900,权重系数w=1/C2。结果表明河蚌糖胺聚糖-FITC荧光标记物在5-120μg·mL-1的浓度范围内线性关系良好。
  按上述条件测得河蚌糖胺聚糖-FITC荧光标记物在大鼠血浆中的最低检测限是2μg·mL-1,最低定量限为5μg·mL-1。
 
  2.1.3精密度试验按标准曲线配制方法制备每批含河蚌糖胺聚糖-FITC荧光标记物低、中、高浓度(浓度分别为8.0、40.0和100μg·mL-1)的含药血浆,每个浓度各5份样品,按照"1.2.4血浆样品预处理"项下操作并进样分析,分别配制测定3批。结果显示低、中、高浓度水平河蚌糖胺聚糖-FITC荧光标记物的批内精密度RSD分别为4.4.%、6.1%和6.5%,批间精密度RSD分别为2.8%、10.6%和4.0%,表明测定精密度良好。
 
  2.1.4准确度试验按标准曲线配制方法制备含河蚌糖胺聚糖-FITC荧光标记物浓度低、中、高浓度的含药血浆,每个浓度各配制5份样品,按照"1.2.4血浆样品预处理"项下操作,进样分析。使用标准曲线计算实测浓度及实测浓度准确度,低、中、高3个浓度水平上的准确度(RSD%)分别为90.0%(3.3)、115.5%(3.5)和89.7%(3.1),结果表明测定准确度良好。
 
  2.1.5提取回收率试验取离心管数支,分别加入空白血浆,每份200μL,除不加标准溶液外按照"1.2.4血浆样品预处理"项下操作,移取空白血浆上清液于干净的塑料离心管中,精密加入河蚌糖胺聚糖-FITC荧光标记物标准溶液适量,配成浓度分别为低、中、高浓度的河蚌糖胺聚糖-FITC荧光标记物溶液,旋涡30 s混匀,吸取混合液转移至自动进样器样品管中,进样分析,记录样品峰面积As。
 
  取离心管数支,精密加入河蚌糖胺聚糖-FITC荧光标记物标准溶液适量,加入200μL空白血浆,旋涡30 s混匀,配成含河蚌糖胺聚糖-FITC荧光标记物分别为低、中、高浓度的含药血浆,每种浓度配制3份样品。按照"1.2.4血浆样品预处理"项下操作,进样分析,记录样品峰面积Ad,将上述As和Ad的比值代入下式,即可求得河蚌糖胺聚糖-FITC荧光标记物的提取回收率(R%)。结果显示,河蚌糖胺聚糖-FITC荧光标记物在低、中、高浓度水平上的提取回收率分别为51.5%、58.6%和51.7%,方法的提取回收率高。
 
  R%=As/Ad×100
 
  2.1.6稳定性试验按标准曲线配制方法制备含河蚌糖胺聚糖-FITC荧光标记物浓度分别为低、中、高浓度的含药血浆各3 mL,每种浓度分取12份,每份200μL。3份于配制好后立即分析、3份于室温放置12小时后、3份于配制好后反复冻融2次后、3份于配制好后放入-20℃冰箱中冷冻保存14天后,分别按"1.2.4血浆样品预处理"项下操作分析。
 
  结果表明,河蚌糖胺聚糖-FITC血浆样品在室温下放置12小时、反复冻融及冰冻放置14天条件下均稳定性良好。
 
  2.2静脉注射给药及样品测定结果
 
  取雄性SD大鼠12只,给药前自由饮食,饮水。将大鼠麻醉后,分别以每200 g大鼠给药0.366 mg的正常给药剂量和4倍正常给药剂量尾静脉注射河蚌糖胺聚糖-FITC衍生物。于给药前及给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4和6 h眼眶取血约500μL,置于预先以肝素处理的离心管中,10000 r·min-1离心10 min,取血浆待测。测定前按"1.2.4血浆样品预处理"方法处理,测定河蚌糖胺聚糖-FITC衍生物的含量。大鼠静脉注射后体内药时曲线见图3。
  实验结果表明,本研究所建立的测定方法可以用于河蚌糖胺聚糖-FITC衍生物在大鼠体内的代谢研究。
 
  3讨论
 
  3.1检测方法的选择
 
  多糖的质量控制分析方法有比色法、毛细管电泳法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法和生物传感器法[11,12],最常用的是比色法和高效液相色谱法。光谱分析法比色法是最经典的多糖含量测定方法,其原理是将多糖水解为单糖后通过显色反应进行定量测定,方法操作繁琐,重现性不好,专属性与灵敏度都较差[13]。
 
  色谱分析法高效液相色谱法可以对样品中多糖组分进行先分离再检测,可以排除杂质对目标化合物测定的干扰,但是由于多糖具有无光学功能团的特点,无法直接使用紫外检测器(UVD)或者荧光检测器(FLD)进行检测,需要使用通用型的示差折光检测器(RID)、蒸发光散射检测器(ELSD)和质谱检测器(MSD)直接检测,或者对多糖进行衍生化反应使之携带共轭基团,然后使用UVD或者FLD进行检测。RID和ELSD灵敏度较低,无法达到药代动力学的检测要求;质谱检测器(MSD)灵敏度高可以满足要求,但是造价昂贵,使用成本较高;通过衍生化反应进行荧光标记可以大大提高多糖的检测灵敏度,达到体内药物分析的要求[9,10,14,15],是多糖等化合物体内代谢研究最常用的手段。
 
  目前国内外尚没有针对河蚌糖胺聚糖的体内分析方法研究的报道,本文首次通过FITC荧光衍生化的手段建立其在大鼠血浆中的分析方法,并进行了完整的方法学考察,证明本方法可靠,灵敏度高,可以用于其在大鼠体内的代谢研究。本实验在分析方法选择的过程中,分别使用了UVD(荧光标记之后)、RID和ELSD作为检测器,但是灵敏度均达不到体内研究的要求,最终选择了灵敏度高的FLD作为检测器。
 
  3.2前处理方法的选择
 
  本实验在血浆样品前处理阶段分别考察了高氯酸、三氟乙酸和饱和硫酸铵作为蛋白沉淀试剂[16,17],发现强酸沉淀试剂会破坏河蚌糖胺聚糖-FITC的荧光性,分析原因可能是强酸试剂与河蚌糖胺聚糖-FITC分子中的某些基团发生了化学反应,通过影响整个分子的平面构型从而降低分子的荧光效率。
 
  作为蛋白沉淀试剂,饱和硫酸铵的不同用量比例(1、2和3倍体积)对比如下:1倍量时沉淀蛋白不完全,有内源性杂质干扰测定;3倍量时沉淀蛋白完全,但是河蚌糖胺聚糖-FITC的提取回收率过低(在沉淀蛋白时损失),且对样品的稀释作用太明显,低浓度样品的检测灵敏度不能满足要求;所以最终选择蛋白沉淀完全且兼顾回收率和灵敏度的2倍量用于沉淀蛋白。
 
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