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氨基糖苷类抗菌药物分析方法的思考及展望

2019-12-23 11:06 出处:未知 人气: 评论(0
  摘要对氨基糖苷类抗菌药物现行有关物质及含量的分析方法进行综述。介绍高效液相色谱蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD),高效液相色谱脉冲安培电化学(HPLC-PAD)等方法在中国药典,美国药典和欧洲药典氨基糖苷类抗菌药物有关物质及含量测定中的使用情况;介绍柱后衍生化方法在检测氨基糖苷类抗菌药物方面应用的特点,并将以上三种方法进行了比较,同时对氨基糖苷类抗菌药物的分析方法发展趋势进行展望。
 
  关键词氨基糖苷类抗菌药物;蒸发光散射检测法;脉冲安培电化学法;柱后衍生化
 
  与其他种类抗菌药物不同,氨基糖苷类抗菌药物在临床上具有严重的耳毒性和肾毒性。这与药物中存在的杂质有着密不可分的关系,尤其是药物中存在的毒性杂质,所以建立有效的分离分析方法,控制有关物质含量,提高药品整体质量是十分紧迫且必要的[1]。本文将对目前氨基糖苷类抗菌药物的分析方法进行综述,为方法开发提供一定的思路。
 
  1国内外药典氨基糖苷类抗菌药物分析方法汇总
 
  氨基糖苷类抗菌药物(aminoglycosides)是临床上常用的抗菌药物,可通过微生物发酵或半合成制得,多为混合物[2],其化学结构是由氨基环醇与氨基糖缩合而成的苷。主要用于治疗由革兰阴性杆菌引起的感染。
 
  氨基糖苷类抗菌药物因不含发色基团,所以无法使用紫外检测器检测。中国药典2015年版对这一类抗菌药物含量的检定多采用微生物检定法和HPLC-ELSD法,有关物质多采用HPLC-ELSD法[3](表1)。国外药典多采用HPLC-PAD法和微生物检定法[4,5](表2)。
 
  2氨基糖苷类抗菌药物主要现行分析方法介绍
 
  2.1微生物检定法
 
  微生物检定法(antibiotics)是一种较为经典的、成本较低、易在国内普及的微生物测定方法。但是微生物法测定的是多组分药品的总效价,因此该法不能完全反映药品的内在质量。且该方法受到的影响因素较多,操作费时[6]。王建等[7]采用微生物检定法和蒸发光散射检定法分析测定阿米卡星洗剂的含量,结果分别为100%和90%,提示微生物检定法无法准确测定该药物含量。
 
  2.2高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD法)
 
  蒸发光散射检测器(evaporativelightscatteringdetector)是一种通用型检测器,原理是当样品随流动相进入检测器后,雾化器使流动相溶剂喷雾汽化,进入加热管后溶剂挥发,而被分析检测的物质颗粒经镭射光产生散射,散射光由光电倍增管收集得到响应。其响应不依赖于物质的光学特征,而是由被分析物质的颗粒的数量和大小决定[8],任何挥发性低于流动相的物质均可被检测[7]。中国药典2015年版中规定使用HPLC-ELSD法,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(pH范围0.8~8.0);0.2mol·L-1三氟醋酸溶液-甲醇(84∶16)为流动相测定硫酸依替米星的有关物质。妥布霉素,硫酸庆大霉素,硫酸小诺霉素等其它氨基糖苷类抗菌药物有关物质检测均规定使用HPLC-ELSD法[2]。吴宏伟等[9]也曾使用HPLC-ELSD法,C18柱来测定硫酸阿米卡星的含量。该方法操作简便、快速[10],一直是测定氨基糖苷类抗菌药物以及其他糖类,皂苷类物质的首选方法[11~14]。但在长期使用过程中也发现了一些不足。
 
  2.2.1流动相的局限性蒸发光散射检测器要求使用高纯无颗粒,易挥发的试剂,溶剂的蒸发残渣值应小于10-6[15]。如果溶液有强的基质效应,光散射强度就会受到抑制[16],这就使得非挥发性盐及烷基磺酸盐类离子对试剂的选用受到限制,不利于色谱系统的优化[17]。
 
  考虑到氨基糖苷类抗菌药物具有极性大,色谱保留弱的特点,一般选择挥发性酸与氨基糖苷类物质形成离子对或者采用碱性流动相使氨基糖苷类抗菌药物离子化程度降低的方式,以增加其在色谱柱上的保留。在上述强酸/强碱色谱系统条件下发现存在以下两方面问题,一方面,有关物质分离较差。朱晓玥等[18~21]分别用HPLC-ELSD与HPLC-PAD法测定硫酸依替米星氯化钠注射液的有关物质时发现HPLC-PAD法测得的杂质总量比HPLC-ELSD法的结果要高,杂质个数也远远多于HPLC-ELSD法,每批样品用HPLC-PED法测得有关物质数量均较HPLC-ELSD法多出10个左右。笔者在用HPLC-ELSD法检测卡那霉素有关物质时也发现,采用中国药典2015年版中控制卡那霉素B的HPLC-ELSD系统分析卡那霉素原料,有三个杂质会同时洗脱,HPLC-ELSD系统分离所得编号为1的杂质实为HPLC-柱后衍生化系统中编号分别为1,2,3杂质的混合物(见图1)。
 
  另一方面,挥发性酸通常选用全氟化羧酸如三氟乙酸,五氟丙酸,七氟丁酸等作为离子对试剂。然而挥发性酸的酸性较强(pH约1.0),长时间使用易影响色谱柱填料和ELSD的稳定性[22]。碱性色谱系统通常选用挥发性碱如氨水等来抑制氨基糖苷类抗菌药物的质子化,同样,液相色谱系统中的流动相碱度过高(pH约10.0),也不利于色谱柱长期使用。
 
  2.2.2蒸发光散射检测器的局限性
 
  2.2.2.1重复性较差及定量误差较大有研究发现分析物的响应会随着流动相中有机比例的增加而增加[23]。ELSD法非线性的响应曲线可使定量分析结果存在较大误差。
 
  2.2.2.2灵敏度较低蒸发光散射检测器的灵敏度与雾化和蒸发过程中形成的粒子的形状,大小和数量有关。每单位物质散射光的数量取决于粒子的平均粒径和粒径分布。任何影响粒子的大小、形状或数量的因素都会影响散射光的强度,影响响应信号的大小[24~26]。蒸发光散射检测器的检测灵敏度远远低于紫外[27]、质谱[28]和电化学检测器。张雷等[29]在用ELSD法分析检测西索米星杂质含量时,对于极微量的杂质难以检出,定量不准。
 
  2.2.2.3其他问题①样品无法回收:ELSD作为一种通用型质量检测器,同时也是一种破坏性检测器样品无法回收,对于比较珍贵的样品无法回收再利用。②样品挥发性要低:ELSD虽然是通用型质量检测器,但是对于一些挥发性比较强的成分,可能在较高的温度下会随着流动相挥发,不适于图1HPLC-ELSD系统与HPLC-柱后衍生化-荧光检测系统对杂质的分析用ELSD检测[30]。③数据处理繁琐:在数据处理方面,采用ELSD法检测,响应值与进样量/进样浓度之间呈指数关系,也即响应值的对数与浓度的对数呈线性相关,这使得分析和定量计算较为繁琐。
 
  HPLC-ELSD法操作简便,快速,这使其在无紫外吸收物质的分析中广泛应用,但其存在的检测灵敏度较低,分离效果较差的问题对于检测药物中的微量杂质仍有很大的限制。
 
  2.3高效液相色谱-脉冲安培电化学法(HPLC-PAD法)
 
  电化学检测器是测量物质的电信号变化的一种检测器(具体分类见表3)。它适用于具有电活性物质的检测。
 
  近年来,欧美等国利用脉冲安培检测器(PulsedAmpero-metricDetector)检测氨基糖苷类抗菌药物的应用呈上升趋势。其药典中已记载应用于多个品种(表2)。在我国,HPLC-PAD法也逐渐成为氨基糖苷类抗菌药物分析研究的一项热点。吴宇宁等[31]运用四电位安培检测器分离检测出依替米星中的22个杂质。HPLC-PAD法虽然具有快速、选择性好、灵敏度高、响应范围宽等优点[32],但也存在着一些难以解决的问题。
 
  2.3.1流动相的局限性与蒸发光散射检测器一样,电化学检测器可以检测那些不含共轭结构无紫外吸收的物质,但要求其具有电化学活性,这就要求实验中涉及到的水和试剂均不能含有电化学活性物质。朱晓玥等[18]发现甲醇中的羟基会在电极表面发生氧化还原反应,四氢呋喃也容易被氧化使得基线本底变高,所以甲醇和四氢呋喃一般不用于HPLC-PAD系统检测中。Manyanga等[33]使用HPLC-PAD系统分离卡那霉素有关物质时发现,有机相易吸附在工作电极的表面,降低电极响应。当流动相中乙腈比例高于15%时,也会产生很高的背景和噪音,几乎覆盖主峰。故有机相浓度的限制将很大程度上影响着电化学方法的普及和推广。
 
  2.3.2实验条件苛刻电化学检测器对电极,流动相组成和实验人员方面要求较高;①电化学检测器的电极易钝化,需要经常清洗,且为获得重现性较好的定量结果,清洗电极之后需要较长的平衡时间[34];②流动相应充分脱气,柱后的加碱溶液里不得含有碳酸盐[18];③实验人员的熟练程度会影响到实验结果,故对实验操作人员要求较高。吴宇宁等[19,20]运用HPLC-PAD法测定硫酸依替米星含量时发现流动相及柱后碱液的脱气方式,塑料瓶瓶装试剂流动相及柱后碱液配置过程等均影响重复性,故配置过程需严格规范。
 
  利用高效液相色谱电化学检测法来测定氨基糖苷类抗菌药物的思路虽已备受欧美等国青睐,但电化学存在的仪器响应不稳定,仪器成本较高等问题,目前仍较难作为常规检测方法在国内普及[35]。
 
  3高效液相色谱-柱后衍生化方法
 
  3.1衍生化方法
 
  衍生化技术一般分为柱前衍生化法和柱后衍生化法。柱前衍生法是指在色谱分析之前,使样品与衍生化试剂反应,待反应转化成衍生物之后,再进色谱系统进行分离和检测[36]。此方法多离线进行,操作繁琐,衍生化副产物多。柱后衍生化技术是分析化学中常用的一种在线处理技术,是指将多组分混合样品注入色谱柱后,在选定的色谱条件下分离,当各组分从色谱柱流出后,在一定的反应条件下先后分别与衍生化试剂反应,生成的衍生化产物再依次进入检测器检测[37]。柱后衍生化方法具有不改变被分离组分的色谱行为,流动相选择限制小,方法简便快速,结果准确可靠,重现性好[38],仪器价格适中等优点。
 
  3.2 高效液相色谱-柱后衍生化方法在氨基糖苷类抗菌药物分析上的应用
 
  对于氨基糖苷类抗菌药物的检测,柱后衍生化技术利用氨基糖苷类抗菌药物结构中的活泼基团如氨基与衍生化试
 
  剂形成具有紫外吸收或荧光的衍生物进行检测。何丹等[39]以邻苯二甲醛(OPA)为衍生化试剂建立了HPLC-柱后衍生化法测定硫酸妥布霉素含量的方法,定量限可达0.34ng(进样10μl)。赵敬丹等[40]以邻苯二甲醛为衍生化试剂建立了柱后衍生化-HPLC-荧光检测法测定硫酸异帕米星注射液的含量和有关物质的方法。采用该方法下异帕米星的检测限为0.57ng,比HPLC-ELSD法的灵敏度高200多倍。杨林等[41]也以邻苯二甲醛为衍生化试剂建立了柱后衍生化高效液相色谱法测定硫酸阿米卡星含量的方法。此方法操作简便、分离能力强、灵敏度高、准确度和精密度好。
 
  但是此方法也存在一些不足:①有文献报道,衍生化试剂如邻苯二甲醛(OPA)、2,4-二硝基氟苯(FDNB)与氨基糖苷类抗菌药物衍生化位点为伯氨基[42],如果目标物中不含伯氨基基团,则无法进行衍生化,从而不会被检测到。秦峰等[43]建立了HPLC柱后衍生化方法和HPLC-PAD法,对庆大霉素样品的有关物质和C组分含量进行了测定。结果发现,电化学方法检测到的小杂质峰的数量较柱后衍生化方法多。原因可能为庆大霉素中的少部分有关物质不含有伯氨基,从而无法进行衍生化反应。②柱后衍生化法还存在一定的柱外效应,这降低了色谱峰之间的分辨率。
 
  4HPLC-ELSD法,HPLC-PAD法与HPLC-柱后衍生化法三种方法比较
 
  与HPLC-ELSD方法相比较,柱后衍生化法和HPLC-PAD法均具有分离效果好,灵敏度高的优点。而HPLC-柱后衍生化法与HPLC-PAD方法相比较,两种方法具有几乎相同的分离能力和灵敏度。就经济适用性方面而言,柱后衍生仪价格适中,易普及;而电化学仪器较昂贵,在国内普及程度不高。见表4。
 
  5总结与展望
 
  本文对氨基糖苷类抗菌药物主要分析方法进行了综述。HPLC-ELSD法具有操作简便的优点,但是分离能力较差,灵敏度较低,这使微量杂质的检出受限。而HPLC-PAD法与HPLC-柱后衍生化法两者虽可弥补上述HPLC-ELSD法的不足,但HPLC-PAD法存在的仪器成本高,对人员和试剂要求较高的缺点,使得其在国内的普及程度并不高。三种分析方法虽有各自的优势与不足,但分析方法的多样性为寻找最适分析方法,提高氨基糖苷类抗菌药物药品质量提供了强有力的保障。
 
  参考文献
 
  1FatenF,AzzazyHM,NiessenWM,etal.Challengesinthedetermi-nationofaminoglycosideantibiotics[J].AnalyticaChimicaActa,2015,890(8):21-43
 
  2ClarotI,RegazzetiA,AuzeilN,etal.NetterAnalysisofneomycinsulfateandframycetinsulfatebyhighperformanceliquidchromatogra-phyusingevaporativelightscatteringdetection[J].JChromatogrA,2005,1087(1-2):236-244
 
  3中国药典[S].2015年版.二部.1309-1311
 
  4USP[S].40thed.2017.4742-4744
 
  5EP[S].9.0thed.2017.2573-2574
 
  6陈秀琳.蒸发光散射检测器在药物分析中的研究概况[J].海峡药学,2007,19(11):93-94
 
  7王建,王知坚,方翠凤.HPLC-ELSD法测定阿米卡星洗剂的含量[J].药物分析杂志,2009,29(6):950-953
 
  8赵灵芝,朱丹妮,严永清.HPLC-ELSD法测定黄芪中黄芪甲苷的含量[J].药物分析杂志,1999,19(6):403-406
 
  9吴宏伟,王珑.HPLC-ELSD法测定硫酸阿米卡星的含量[J].中国药品标准,2007,8(3):34-35
 
  10洪专,黄宏南,许晨,等.HPLC-ELSD测定氨基葡萄糖含量[J].中国卫生检验杂志,2007,17(6):1025-1026
 
  11ZhangY,HeH,ZhangJ,etal.HPLC-ELSDdeterminationofkana-mycinBinthepresenceofkanamycinAinfermentationbroth[J].BiomedChromatogr,2015,29(3):396-401
 
  12苏晓楠,季德,周亚萍,等.HPLC-DAD-ELSD同时测定知母中黄酮和皂苷类成分的含量[J].中国中药杂志,2015,40(1):108-111
 
  13熊雯,袁涛.HPLC-ELSD测定硫酸庆大霉素有关物质及其C组分质量标准改进[J].中国抗菌药物杂志,2011,36(10):775-777
 
  14张建革,刘英,王立萍.HPLC-ELSD测定硫酸庆大霉素注射液含量及其有关物质的研究[J].华西药学杂志,2010,25(1):80-82
 
  15戴向东,李慧义,张启明,等.HPLC-ELSD法测定硫酸新霉素的含量及有关物质新霉胺[J].药物分析杂志,2007,27(2):212-215
 
  16ChristianCOR,MenzingerF,MaierEJ,etal.SimultaneousQuantifi-cationofNeomycinandBacitracinbyLC-ELSD[J].ChromatogrA,2009,69(11-12):1181-1188
 
  17王巧娥,丁明玉.蒸发光散射检测技术研究进展[J].分析测试学报,2006,25(6):126-132
 
  18朱晓玥,赵卫,袁耀佐.HPLC-PAD法测定硫酸依替米星氯化钠注射液中有关物质[J].药物分析杂质,2013,33(12):2151-2155
 
  19吴宇宁,朱晓玥,赵卫,等.HPLC-PED法测定硫酸依替米星原料药的含量及有关物质[C].河北:中国药学大会暨中国药师周论文集,2014
 
  20吴宇宁,赵卫,朱晓玥,等.硫酸依替米星含量测定及有关物质反相高效液相色谱-脉冲安培电化学法的建立[J].中国药学杂志,2015,50(20):1797-1802
 
  21吴宇宁,赵卫,朱晓玥,等.LC-PED法测定硫酸依替米星注射液及硫酸依替米星氯化钠注射液中有关物质[J].中国抗菌药物杂志,2016,41(8):618-623
 
  22郑妍,高琳.HPLC-ELSD法测定妥布霉素滴眼液的含量[J].西北药学杂志,2011,26(4):259-261
 
  23MathewsBT,HigginsonPD,TaylorMR,etal.Improvingquantita-tivemeasurementsfortheevaporativelightscatteringdetector[J].ChromatogrA,2004,60:625-633
 
  24MichelRighezza,GeorgesGuiochon.Effectsofthenatureofthesol-ventandsolutesontheresponseofalight-scatteringdetector[J].JLiquidChromatogr,1988,11:1967-2004
 
  25RighezzaM.Effectofthewavelengthofthelaserbeamonthere-sponseofanevaporativelightscatteringdetector[J].JLiquidChro-matogr,1988,11:2709-2729
 
  26GeorgesGuiochon,MoysanA,ChristopherHolley.Influenceofvari-ousparametersontheresponsefactorsoftheevaporativelightscatter-ingdetectorforanumberofnon-volatilecompounds[J].JLiquidChromatogr,1988,11:2547-2570
 
  27饶竹,李松,何淼,等.高效液相色谱-荧光-紫外串联测定土壤中16种多环芳烃[J].分析化学,2007,35(7):954-958
 
  28HankoVP,RohrerJS.Determinationofneomycinsulfateandimpuri-tiesusinghigh-performanceanion-exchangechromatographywithinte-gratedpulsedamperometricdetection[J].JPharmBiomedAnal,2007,43:131-141
 
  
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