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毛细管电泳应用于体内药物分析的新技术

2020-09-23 09:24 出处:未知 人气: 评论(0
  摘要综述了近年来毛细管电泳在体内药物分析应用中的几种新技术:场放大、等速电泳、特异性在柱预浓缩和非特异性在柱预浓缩。它们各具特色,使毛细管电泳更显优越性。
 
  关键词毛细管电泳场放大等速电泳色谱预浓缩
 
  毛细管电泳(CE)是80年代后期在世界范围内迅速发展起来的一种分离分析技术。其分析应用的范围极广,小至无机离子,大至生物大分子,都可以用CE来测定。对于体液样品,如血清、血浆、尿等的分析,CE也显示了它特有的优越性:高效,快速,样品和试剂耗用量少,可供选择的分离模式多,适应性广。
 
  CE系统是依据带电粒子的电迁移差异而实现物质的分离。带电粒子的大小、形状及有效电荷的差异,构成了电泳分离的基础。CE的常用进样方式有流体动力学进样和电动进样,进样量很少,约为几十nl。
 
  体液样品成分复杂,待测物浓度一般都很低,为大大提高检测灵敏度,可使用高灵敏度检测器或对样品进行预浓缩处理。
 
  1样品制备方法及其发展
 
  在体内药物分析中,C E对样品的预处理要求,没有HPLC和GC那么严格。为避免体液样品中的蛋白质和盐等基质对分析测定的干扰,常用的预处理方法有萃取法和沉淀法。
 
  萃取法又分液-液萃取(liquid-liquid ex-tractio n,LLE)和固相萃取(so lid phase ex-tractio n,SPE),都是基于待测物质在两相之间分配行为的差异。在LLE的基础上,发展了膜技术[1,2];在反向SPE的基础上,亦发展了双机制(double-m echa ni sm)SPE[3]。
 
  待测物浓度足够大时,可离心进样或经简单离心过滤后进样。若样品中含盐和蛋白质,可用在柱微渗析或小孔聚丙烯酰胺凝胶将待测物与上述基质分离。待测物分子较小且与高浓度蛋白质混合时,可用超滤法或排阻色谱法分离。
 
  2在柱预浓缩技术
 
  近年来在CE应用中出现了各种在柱预浓缩(on-line preco ncentratio n)技术,如场放大、样品堆积、等速电泳、色谱预浓缩等。
 
  2.1场放大
 
  将样品溶解于稀释后的背景电解质(backg round-el ectroly te,BGE)中,加电压后,样品溶液的电场强度高于BGE,样品离子加速迁移,至与BGE交界处时,迁移速度放慢,于是样品离子在交界处发生堆积而得到富集[4]。
 
  Zhang等[5]采用柱头场放大浓缩血浆中
 
  乙胺碘呋酮及其代谢物去乙基乙胺碘呋酮,检测限达70nmo l/L,测定结果与HPLC相同,大大节省了分析时间。
 
  2.2等速电泳(i so tachophoresis,I TP)
 
  IT P是电流通过不连续电解质系统而引起的电泳。样品区带界于前导电解质和尾随电解质之间,样品离子按迁移速度大小连续排列。在I TP同时,施加一与电渗流(EOF)反方向的压力,压缩样品区带;待稳定后,撤去反向压力,加电压使样品区带迁移至进样口端,进行区带电泳(capillary zone elec-tro phoresis,CZE)。
 
  Mazereeuw等用ITP-CZE测定新斯的明和普鲁本辛,检测限达2.5×10-9 mol/L,但浓缩时间长达2h。将液-液电萃取(elec-troex t ra tio n,EE)与I TP结合起来,可缩短浓缩时间。Van der Vlis等[7]采用EE-I TP-CZE测定普鲁本辛、新斯的明等,浓缩时间只需几分钟,检测限达5×10-9 mo l/L。
 
  2.3在柱色谱预浓缩
 
  在柱色谱预浓缩采用了浓缩微反应室[8,9],该方法可浓缩较大体积样品中的痕量组分,并同时脱盐和提纯。根据微反应室中作用类型的不同,该法可分为非特异性在柱预浓缩和特异性在柱预浓缩。
 
  2.3.1非特异性在柱预浓缩浓缩微反应室中含有非特异性固体填料,两端固定多孔聚合物塞。样品中待测物键合到固体填料上,CE缓冲液洗脱除去基质和试剂,改变洗脱液,并以少量洗脱液使待测物解离,实现了样品的提纯和浓缩,然后恢复CE缓冲液,进行分析测定。该技术称为固相预浓缩-毛细管电泳(solid-phase preco ncentratio n-CE,spPC-CE)。
 
  由于spPC-CE中填料和多孔塞具有阻碍作用,会改变物质迁移时间。采用涂布/浸渍膜(coa ted/im preg nated membrane)代替填料和多孔塞,可避免上述问题,此技术称为膜预浓缩-毛细管电泳(membrane precon-centratio n-CE,m PC-CE)。
 
  m PC-C E常与M S联用,能提供更多的定性信息。To mlinso n等[10]采用m PC-C E-M S分析病人服用小剂量强安定药氟哌啶醇后尿样中代谢物,进样10μl,用80nl甲醇洗脱膜上待测物,可测出氟哌啶醇及其三种代谢物。与常规C E相比,进样量大大增加。
 
  2.3.2特异性在柱预浓缩利用亲合色谱原理,将具有特异性的配体共价键合到微反应室中载体上,配体与相应生物大分子能特异地可逆地相互作用。抗体常作为亲合配体,与样品中抗原结合,用少量洗脱液冲洗,使免疫复合物裂解,释放出抗原,从而实现抗原物质的提纯和浓缩。采用单克隆抗体,可获得所需的特异性和结合力,且洗脱温和,此方法称为免疫亲合毛细管电泳(imm unoaffinity CE,IACE);若采用植物凝集素或酶作亲合配体,则分别称为植物凝集素亲合毛细管电泳(lectin affinity CE,LACE)和酶亲合毛细管电泳(enzyme affi ni ty CE,EACE)。
 
  近年来有人采用毛细管束(multiple capilla ry bundles)或微孔玻璃代替微反应室柱体[11],在这种模型中,没有固体填料和多孔塞,能产生更为恒定的EOF,特异性配体直接键合到毛细管内壁。
 
  药物分子作为半抗原与载体蛋白质结合成全抗原,实现免疫分离。在柱IACE于治疗药物监测方面有广阔的应用前景,已有学者将该方法用于监测血清中地高辛[12],还用于甾体激素氢化可的松的内分泌失调诊断。
 
  3CE在体内药物分析中的应用展望
 
  目前,体内药物分析如药代研究、治疗药物监测、滥用药物测定等,主要应用HPLC,但采用HPLC时,样品预处理既费时又费力,平衡时间和分析时间较长,且耗用大量流动相。而采用CE,通过对体液样品进行浓缩预处理,可提高检测灵敏度,降低浓度检测限,扩大了分析范围。然而,CE的灵敏度仍低于HPLC,尚待进一步研究与完善。
 
  参考文献
 
  1Palmar sdo ttir S,M athia sso n L,Jo nsso n JA,et a l.Determina tio n o f a basic dr ug bam-buter ol in human plasma by capilla ry elec-tro pho resis using do uble stacking fo r la rg e v ol-ume injection a nd suppo rted liquid menbra ne for sample pret reatment.J Chromatogr B,1997,688(1):127
 
  2Ling ema n H,Hoekstr a-O usso ren S JF.Par ticle-lo aded membra nes fo r sa mple concentra tion and/o r clea n-up in bioanalysis.J Chromatogr B,1997,689(1):221
 
  3Tag liar o F,T ur rina S,Pisi P,et al.Determi-na tion o f illicit and/o r a bused drugs a nd co m-po unds o f fo r ensic inter est in biosamples by ca pillary electr opho r etic/electro kinetic meth-o ds.J Chromatogr B,1998,713(1):27
 
  4Gebauer P,Tho rmann W,Bo cek P.Sample selfstacking in zone electro pho resis.Theo re ti-cal descriptio n of the zo ne elect ropho retic sep-a ration o f mino r compounds in the presence of bulk amo unts of sample compo nent with highmobility and like charg e.J Chromatogr,1992,608(1~2):47
 
  5Zhang CX,Tho rma nn W.Head-column field-amplified sample stacking in binar y capillar y elect ropho resis:a r obust a ppro ach pr oviding ov er 1000-fold sensitiv ity enha ncement.Anal Chem,1996,68(15):2523
 
  6M a zer eeuw M,T jaden U R,V an der Greef J.In-line iso tachopho retic focusing o f v ery larg e injection v olumes fo r capillar y zone elec-
 
  tro pho resis using a hy drodynamic co unte r-flo w.J Chromatogr A,1994,677(1):151
 
  7V an der V lis E,M a zer eeuw M,Tja den U R,et al.Combined liquid-liquid electr oex tra ctio n and isotachopho resis as a fast o n-line focusing step in ca pillar y electr oph or esis.J Chromatogr A,1994,687(2):333
 
  8Guzman N A,Par k SS,Scha ufelberg er D,et al.N ew a ppro ach es in clinical chemistry:on-line analyte concentra tion a nd micro r ea ctio n ca pillar y electr opho resis fo r the de termina tio n of drugs,metabo lic inter mediates,and bio po ly-mers in biological fluids.J Chromatogr B,1997,697(1/2):37
 
  9T omlinson A J,Benso n L A,Guzman N A,et al.Pr econcentration and micro reaction technolog y on-line with capilla ry elect ropho resis.J Chro-matogr A,1996,744(1):3
 
  10.Guzma n N A.Bio medical applications o f on-linepreconcentra tio n capillar y electro pho resis us-ing an analyte co ncent rato r:inv estiga tio n of desig n optio ns.J Liq Chromatogr,1995,18(18/19):3751
 
  11.Liu X H,X u Y,Ip M PC.Capilla ry elec-tro pho re tic enzym e imm unoa ssay fo r pigo xin in huma n urine.Anal Chem,1995,67(18):3211
 
  12.Schmalzing D,Na shabeh W,Yao XW,et al.Ca pillar y electr oph or esis-ba sed immuno assa y for co r tisol in ser um.Anal Chem,1995,67(3):606
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