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基于液相色谱法的洛匹那韦/利托那韦血药浓度分析研究进展

2020-09-17 11:02 出处:未知 人气: 评论(0
  摘要洛匹那韦/利托那韦是《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》的推荐药物。洛匹那韦/利托那韦作为特殊情况下治疗COVID-19的药物,其相关的有效性和安全性数据尚未确立,有必要开展治疗药物监测(TDM),以确保在获得良好疗效的同时避免/减轻毒副反应,并为药物毒副作用的诊断和处理提供有价值的实验室依据,将临床用药从经验模式提高到比较科学的水平。本文综述了近年来洛匹那韦/利托那韦基于液相色谱法的血药浓度测定方法研究进展,包括高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、超高效液相色谱法等,以及相应的样品前处理方法,为本次COVID-19治疗药物的TDM工作提供参考。
 
  关键词COVID-19;洛匹那韦;利托那韦;体内药物分析;治疗药物监测
 
  针对2019年12月以来肆虐的β属新型冠状病毒(SARS-Cov-2)感染导致的肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19),国家卫健委基于临床诊疗经验积累发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》,明确将洛匹那韦/利托那韦(结构见图1,化合物基本信息见表1)作为一线治疗药物[1]。洛匹那韦作为HIV-1蛋白酶抑制药,可阻止Gag-Pol多聚蛋白的分裂,导致产生未成熟的、无感染力的病毒颗粒。洛匹那韦单独口服的血药浓度低而短暂,与低剂量利托那韦合用时,由于其CYP3A4代谢被抑制,从而达到较高的血药浓度[2],因此,基于二者的协同作用,雅培制药以4:1的比例制成复方片剂上市(商品名克力芝)。
 
  洛匹那韦/利托那韦作为基于以往经验的超说明书应用于治疗COVID-19[3-4],其相关的有效性和安全性数据尚未确立,因此卫健委的诊疗方案中也明确指出“要注意洛匹那韦-利托那韦相关腹泻、恶心、呕吐、肝功能损害等不良反应,同时要注意和其他药物的相互作用”。随着药物的大规模使用,治疗药物监测(therapeutic drug monitoring,TDM)的必要性日渐凸显。通过TDM,可以在获得良好疗效的同时避免/减轻毒副反应,而且还可以为药物毒副作用的诊断和处理提供有价值的实验室依据,将临床用药从经验模式提高到比较科学的水平。本文综述了近年来洛匹那韦/利托那韦基于液相色谱法的血药浓度测定方法研究进展,包括高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、超高效液相色谱法等,以及相应的样品前处理方法,为本次COVID-19治疗药物的TDM工作提供参考。
  1样品前处理方法
 
  除蛋白是血药浓度测定的最重要前处理步骤。去除蛋白不但可以使结合型药物从蛋白中释放出来,以便测得药物的总浓度,而且可以减/避免样品富集过程中的发泡、乳化等现象,同时还可以避免蛋白等杂质沉积在色谱柱上从而延长色谱柱的使用寿命[5]。乙腈等有机溶剂沉淀蛋白法是洛匹那韦/利托那韦的血药浓度分析中去蛋白的经典方法[6-10],如Rajasekhar Damaramadugu等用移液管将100μL血浆样品移入小瓶中,加入20μL内标化合物后旋涡混匀,再加入乙腈900μL,将样品旋转混合1min后在4℃下以4 000 r·min-1的速度离心20 min,将上清液转移至HPLC样品瓶即可[7]。
 
  液液萃取作为一种经典的样品前处理方法,也被用于血样中洛匹那韦/利托那韦的液液萃取[11-14],其中以乙酸乙酯最为常用,如邹尚荣等向0.25 mL血浆中加入50µL内标后涡旋振荡3 s,再加乙酸乙酯1 mL涡旋振荡1 min后以13 000 r·min-1离心5 min,将所得上清液转移至真空干燥,最后加入流动相溶解、离心、吸取上清液进样[12]。另外还有分别使用叔丁基甲醚[15]、正己烷与乙酸乙酯(1:1,V/V)的混合溶剂[16]作为溶剂的液液萃取方法,其操作与乙酸乙酯萃取法类似。为达到更好的去除蛋白和其它杂质的效果,还可以蛋白沉淀联合溶剂萃取的方法,如先用乙腈沉淀、再用乙酸乙酯萃取[17],或先用叔丁基甲基醚萃取、再用乙腈沉淀[18]等。
 
  固相萃取(Solid-Phase Extraction,SPE)是基于选择性吸附、选择性洗脱的一种样品前处理方式,其突出优点是样品的富集与净化同时完成,减少了样品预处理过程,非常适合于低浓度样品的前处理,比液液萃取更快、更节省溶剂,可自动化批量处理、重现性好[19-21]。如ManishYadav等在向100μL血浆中分别加入50μL内标物、100μL 10%甲酸后旋涡混合均匀,然后于Oasis HLB extraction cartridges(30 mg·mL-1)萃取柱上样,随后用5%甲醇冲洗1 mL,然后在2.4 L·min-1氮气流速下25 psi干燥2 min,最后用0.5 mL甲醇(含0.2%甲酸)洗脱即得[19]。
 
  采用上述样品前处理方法,测得的是血样中洛匹那韦/利托那韦的总浓度。为了获得游离药物浓度,超滤法越来越多地被应用到血浆中游离洛匹那韦/利托那韦的定量分析工作之中[10,22-24],如Illamola等通过超滤法实现了血浆中游离洛匹那韦的测定,并对比了使用乙腈沉淀蛋白法测得的总洛匹那韦含量差异[10],而Rita C等则在超滤之后再用叔丁基甲醚液液萃取,进一步纯化了样品,获得了很好的效果[25]。
 
  此外,由于检测标本存在传染风险,在进行标本采集操作时应注意生物安全防护,标本样品应专柜冷藏保存,接触样品前应正确穿戴防护口罩、护目镜、乳胶手套、一次性鞋套、防护服,确保在标本提取过程中不直接接触到样品,采样过程应在生物安全柜中进行且尽量使用和相关仪器相匹配的一次性器具,采集之后快速密闭防止微生物气溶胶扩散,再将提取后的标本自动上机检测,检测完成后,按照标准操作规程对防护服消毒后依次脱下生物安全防护装备,对于实验操作过程中产生的废弃物需及时经过高压灭菌后贴好标签放入指定的安全区域,再按医疗垃圾进行统一处理。
 
  2仪器分析方法
 
  2.1.高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)
 
  HPLC法作为经典的药物体内分析方法[26],在洛匹那韦和利托那韦的测定中应用较早,国内外科研工作者对此进行了大量的研究[6,11,13,15,20,27-31]。从现有文献报道来看,HPLC法测定血样中洛匹那韦/利托那韦的浓度,存在的唯一不足之处是低波长检测(大多是在205 nm左右),这导致有可能出现基线漂移、平衡时间过长的问题,尤其是很多方法的流动相中使用了缓冲溶液;另外,低波长检测也使得方法的检测限较高,不太适合于低浓度样本的分析。
 
  2.2.高效液相色谱-质谱联用法(High-performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS)
 
  随着质谱技术的进步和仪器的普及化,HPLC-MS越来越多地应用于生物样品中洛匹那韦和利托那韦的测定。HPLC-MS体现了色谱和质谱的互补优势,将色谱的高分离能力与质谱的高选择性、高灵敏度充分结合起来,使得即使待检化合物在色谱上没有完全分离开,但通过质谱也可定量测定,从而大大提高了测定结果的准确度和仪器分析效率;同时,质谱的高灵敏度使得其检测限较之紫外检测器大大提高至少3个数量级以上,这些优势使得HPLC-MS非常适合于血浆等生物样品中洛匹那韦和利托那韦的定量测定[7,10,12,14,17,22,32-36]。
 
  HPLC-MS分析的离子源大多是电喷雾电离(Electron spray ionization,ESI),这是一种软电离技术,通常只产生[M+H]+、[M+Na]+、[M-H]-等分子离子峰,非常适合化合物母离子的确认。洛匹那韦和利托那韦都是含氨态氮的化合物,因此在正离子模式下质谱响应极佳。定量分析一般使用三重四级杆分析器(QqQ),洛匹那韦和利托那韦的母离子(m/z 629和m/z 721)进入碰撞室后,通过氦气发生离子-分子碰撞反应后产生一系列子离子,最后经分析器接受子离子至检测器收集信号。文献报道用于洛匹那韦和利托那韦定量的子离子分别是m/z 447、m/z 155、m/z 296、m/z 268和m/z 140,其可能的质谱碎裂模式见图1。现有报道的洛匹那韦和利托那韦HPLC-MS分析大多是利用ESI来电离,Chu等报道了一种使用大气压化学电离(Atmospheric pressure chemical ionization,APCI)的HPLC-MS分析方法:由于洛匹那韦和利托那韦的极性较低,改用APCI离子源后有效地降低了基质效应引起的背景噪音,同时简化了样品的前处理过程,获得了更好的分析效果[32]。类似地,Wang等也报道了使用APCI离子源的HPLC-MS测定方法[16]。除了QqQ外,四级杆/飞行时间质谱
 
  (quadrupole/time-of-flight,q/TOF)也被用于定量分析,通过特异性、选择性、线性、LOD、回收率、精密度和准确度等验证,表明q/TOF可以用于HIV感染患者血药浓度测定。虽然TOF的检测限有可能比QqQ要差,但是TOF作为高分辨质谱可以获得化合物的精确分子量,其全扫描谱提供的定性信息可用于同时准确鉴别HIV感染患者血浆中拉米夫定、洛匹那韦、利托那韦和齐多夫定等多个化合物[21]。
 
  HPLC-MS定量分析需要使用内标化合物,一般使用结构类似物的情况较多,但Yadav M.团队和Djerada Z.团队分别使用洛匹那韦和利托那韦的氘代同位素作为内标物获得了更好的测定效果[8,19]。
 
  除了定量分析,Marzinke等还报道了一种高通量定性方法的开发与验证,该方法使用高分辨率质谱(Exactive-MS)多重检测了15种抗逆转录病毒药物,包括9种蛋白酶抑制剂(PIs)、4种核苷酸/核苷逆转录酶抑制剂(NRTIs)和2种非核苷酸/核苷逆转录酶抑制剂(NNRTIs)。在Hypersil-Gold-PFP(100 mm×3 mm)柱上进行了分离,并使用全扫描模式下对洗脱液进行了分析。使用临床血浆样品,通过对检测限、信号强度精度、保留时间分析、选择性和残留等进行研究,表明该方法与液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法具有一致性[37]。
 
  2.3.超高效液相色谱-质谱联用法(Ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry,UPLC-MS)
 
  虽然UPLC与HPLC的分离理论一样,但其涵盖了小颗粒(<2μm)填料、快速分离和极低死体积等全新技术,增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量,较之HPLC更适合与质谱联用[38],使用UPLC-MS/MS测定洛匹那韦和利托那韦也有相应报道[8-9,19]。但由于UPLC仪器的普及度不高,因此其研究报道较少。
 
  具有代表性的洛匹那韦和利托那韦液相色谱及液相色谱-质谱联用的定量分析研究汇总于表2。
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