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高通量甲基衍生化固相萃取 LC-MS/MS 法定量测定人血浆内的米诺膦酸

2020-09-17 10:59 出处:未知 人气: 评论(0
  摘要:采用氘代米诺膦酸为内标,建立了高通量衍生化固相萃取LC-MS/MS的定量方法检测人血浆中的米诺膦酸(1)。将血浆样品300?l上样于弱阴离子交换96孔固相萃取板上,配合正压装置在pH 7.0避光条件下与三甲基硅烷化重氮甲烷(TMS-DAM)发生衍生化反应,洗脱液于烘箱70℃反应1 h使衍生化完全。以Eclipse XDB苯基柱为色谱柱,流动相为乙腈∶含0.15%甲酸10 mmol/L乙酸铵溶液,线性梯度洗脱。采用电喷雾离子源(ESI),正离子模式,以多反应监测(MRM)扫描方式进行监测,用于定量分析的离子对为m/z 393.2→m/z 267.1(五甲基米诺膦酸)和m/z 397.1→m/z 271.2(D4-五甲基米诺膦酸)。本法线性范围为10~1 500 pg/ml,批内RSD为2.6%~7.5%,批间RSD为2.5%~7.9%;本法提取回收率为89.7%~96.8%,基质效应为96.9%~102.3%。本方法灵敏、快速、高通量,可用于人血浆中1的含量测定和临床研究。
 
  关键词:米诺膦酸;衍生化;固相萃取;液质联用;体内药物分析
 
  双膦酸盐类(bisphosphonates,BPs)药物是一类抗代谢性骨骼疾病药物,主要用于治疗骨质疏松症、高钙血症、骨痛症等疾病。米诺膦酸(minodronic acid,1)是一种新型杂环双膦酸类化合物,用于治疗骨质疏松症以及由骨质疏松症和恶性肿瘤引起的高钙血症。1通过抑制破骨细胞内焦磷酸法呢酯(FPP)合成酶的活性、抑制破骨细胞的骨吸收、降低骨转换,起到防治骨质疏松的效果。1的优势表现在:与目前临床上常用的双膦酸盐比较,其抑制骨吸收的活性较强,是英卡膦酸二钠的2倍、阿仑膦酸的钠的10倍、帕米膦酸二钠的100倍[1—3]。关于BPs药品质量控制的分析方法已有很多报道[1]。随着BPs在临床上的广泛应用,该类药物的质量控制向临床治疗、药物监测、药代动力学研究等方面深入发展[4]。由于该类药物具有与骨组织亲和力强、化学结构大部分无生色基团、极性强、位阻较大、不挥发等理化性质,给生物样品分析带来很多困难[5—7]。1片经口服给药后血药浓度低,c约200 pg/ml[3]。文献报道采用柱切换离子对高效液相色谱法定量检测1,最低定量下限(LLOQ)为50 pg/ml[8],但不适于实际应用;另有文献报道柱上衍生化液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法的LLOQ为10 pg/ml,但该法须使用人血浆1 ml和固相萃取小柱(柱管容积6 ml,填料量150 mg)[5],步骤多、耗时长,不适用于样本量大的试验。因此有必要开发一种高灵敏、更易于操作的高通量LC-MS/MS法检测生物样品中1浓度,为其药动学研究、治疗药物监测提供有效分析手段。
 
  甲基衍生化试剂可以与含有羧基、羟基等极性基团的化合物反应,生成甲基化产物,降低化合物极性,改善化合物的色谱保留行为。离子交换固相萃取是处理含有BPs生物样品的常用技术[6]。通过离子交换和固相萃取可较好地达到纯化和富集样品的目的,为进一步分析奠定基础。采用弱阴离子交换固相萃取法,将强酸性分析物保留在阴离子交换柱中,先将其他杂质除去,再用适当的溶剂洗脱即得所需分析物[8—9]。本试验基于甲基衍生化及弱阴离子交换色谱的原理,将1及其同位素内标D4-1(2)经衍生化反应转化为五甲基米多膦酸(3),D4-五甲基米诺膦酸(4)后进行LC-MS/MS分析,现将结果报道如下。
 
  1仪器与试药
 
  LC-30AD型液相色谱仪(日本Shimadzu公司);API5500型质谱仪(美国Applied Biosystems/Sciex公司);Milli-QDirect纯水仪型(美国Millipore公司);96孔正压装置(Positive Pressure-96 Processor,美国Waters公司)。
 
  1(纯度99.9%,批号1451-02AI)和2(纯度99.9%,批号2198-041A3)(加拿大TLC PharmaceuticalStandards公司);三甲基硅烷化重氮甲烷(TMS-DAM,上海阿达玛斯试剂有限公司);乙腈、甲醇、甲酸、异丙醇、乙酸铵为色谱纯,水为超纯水。
 
  健康受试者的空白及含1[受试者口服1片(规格1 mg,日本Astellas制药集团)]血浆(乙二胺四乙酸抗凝,辽宁中医药大学附属医院,各受试者均签署知情同意书)。
 
  2方法与结果
 
  2.1色谱条件
 
  色谱柱Eclipse XDB苯基柱(4.6 mm×150 mm,5?m);流动相乙腈(A)∶含0.15%甲酸的10 mmol/L乙酸铵溶液(B),洗脱程序见表1;柱温40℃;进样器样品室温度8℃;检测时间5.20 min;流速1.0 ml/min;进样量10?l。
  2.2质谱条件
 
  离子源电喷雾离子源(ESI);离子检测方式多反应监测(MRM);离子极性正离子;离子源温度600℃;离子喷雾电压5 500 V;气帘气(CUR)172.4 kPa;碰撞气(CAD)55.2 kPa;雾化气(GS1)413.7 kPa;辅助气(GS2)448.2 kPa。监测离子对:m/z 393.2→m/z 267.1(3)和m/z 397.1→m/z 271.2(4)。
 
  2.3溶液及血浆样品的配制
 
  精密称取2适量,经质量校正系数校正后,用纯水溶解并制得终浓度为50?g/ml的内标贮备液,置-20℃冰箱中保存。用50%甲醇将内标贮备液稀释成1 400 pg/ml的内标工作溶液。
 
  精密称取1适量,经质量校正系数校正后,用纯水溶解并制得终浓度为50?g/ml的贮备液,置-20℃冰箱中保存。将1贮备液用50%甲醇定量稀释为系列浓度(0.20、0.40、1.00、20.0、60.0、180、270和300 ng/ml)的对照品溶液,使用时各取15?l加至空白血浆285?l中稀释混匀,作为标准曲线血浆样品。
 
  将1对照品溶液用50%甲醇定量稀释成0.50、2.40和24.0 ng/ml的质控样品工作溶液,使用时取15?l加至空白血浆285?l中稀释混匀,作为低、中、高浓度(25、120和1 200 pg/ml)的1质控样品。
 
  2.4血浆样品预处理
 
  2.4.1样品稀释
 
  向离心管中加含1的血浆样品300?l,加入10 mmol/L乙酸铵水溶液∶内标工作液(6∶1,即稀释液)300?l,混匀。
 
  2.4.2柱上衍生化
 
  固相萃取柱的活化:弱阴离子Oasis WAX固相萃取柱(60 mg,30?m)依次用甲醇1 ml和纯水1 ml于低流速(20.7 kPa)进行活化。
 
  上样:常压下,将离心管中的血浆样品转移至固相萃取柱进行上样,用低流速洗脱。
 
  淋洗:分别用纯水1 ml和甲醇1 ml对已上样的固相萃取柱进行淋洗,用低流速淋洗。
 
  衍生化反应:①在固相萃取柱内依次快速加入甲醇∶水(12∶1)225?l与衍生化试剂(即含2 mol/L TMS-DAM的正己烷溶液)75?l;②快速
 
  重复1次步骤①,反应30 min,收集该步骤的洗脱液;③将洗脱液重新上样至固相萃取柱中,反应30 min;④再次加入甲醇∶水(12∶1)225?l与衍
 
  生化试剂75?l反应20 min。收集上述全部洗脱液,置70℃烘箱中,衍生化反应1 h至衍生化反应充分完全。
 
  吹干:取出反应后的样品,于45℃氮气吹干。
 
  复溶:残留物中加入纯水100?l,涡旋混匀后进行LC-MS/MS分析。
 
  “2.3”和“2.4”项下步骤均在避光条件下操作进行。
 
  2.5方法学验证试验
 
  2.5.1专属性试验
 
  取空白血浆,除不加内标工作液(以50%甲醇代替)外,按“2.4”项下方法操作,获得空白样品的色谱图;空白血浆样品中加入1对照品溶液和2工作液,按“2.4”项下方法操作,获得加标血浆样品色谱图,考察方法专属性。结果见图1。
 
  由图1可知,3和4峰形良好,分离效果佳,3和4的保留时间分别为3.62和3.63 min,血浆中的内源性物质不干扰3和4的测定,提示本法专属性良好。
 
  2.5.2线性试验
 
  将“2.3”项下的系列浓度血浆样品(浓度分别为10、20、50、100、300、900、1 350和1 500 pg/ml),按“2.4”项下方法处理后,以1浓度(c)为横坐标,3与4的峰面积比(Y)为纵坐标,用加权最小二乘法进行线性回归,加权系数为1/c2,计算得回归方程Y=0.701c+0.002 2,r=0.996 8。表明血浆中1浓度在10~1 500 pg/ml范围内线性关系良好。
 
  连续3 d,每天照“2.3”项下方法平行配制1浓度为10 pg/ml的血浆样品,各6份,照“2.4”项下方法处理后进样分析,由随行标准曲线计算1浓度。3 d测得的1平均值分别为10.6、10.7和10.0 pg/ml,计算得日内RSD分别为2.8%、2.3%、2.4%(n=6),日间RSD为4.0%(n=18),因此确定1的定量下限(LLOQ)为10 pg/ml。
 
  2.5.3准确度与精密度试验
 
  取“2.3”项下低、中、高浓度(25、120和1 200 pg/ml)的1质控样品各6份,按“2.4”项下方法处理后进样分析,由随行标准曲线计算各样品中的1浓度。连续测定4批,计算得低、中、高浓度样品的批内RSD分别为7.5%、2.6%和2.6%(n=6),批间RSD分别为7.9%、2.5%和3.3%(n=24),准确度分别为97.1%、102.2%和103.7%(n=24)。
 
  2.5.4提取回收率试验
 
  取“2.3”项下低、中、高浓度(25、120和1 200 pg/ml)的1质控样品各6份,照“2.4”项下方法处理后,分别进样分析,得到峰面积比值A。取空白基质照“2.4”项下方法处理至吹干;照“2.3”项方法配制1浓度分别为75.0、360和3 600 pg/ml的对照品溶液代替空白血浆,继续照“2.4”项下对上述吹干的空白基质进行复溶处理,然后进样分析,得到峰面积比值B。以B/A计算提取回收率。结果表明,低、中、高浓度样品的提取回收率分别为(90.2±7.1)%、(96.8±2.4)%和(89.7±3.0)%,RSD分别为7.9%、2.5%和3.3%(n=6);内标的提取率为(87.5±4.6)%,RSD为5.2%(n=6)。
  2.5.6基质效应
 
  取6个来自不同供体的空白血浆基质,每个基质各取9份(分别对应高、中、低质控样品,每个浓度3份),照“2.4”项下(其中“2.4.1”项下的内标工作液替换为50%甲醇)方法处理至吹干。另外,用纯水代替空白血浆,同上操作。
 
  配制1高、中、低对照品溶液(3 600、360和75 pg/ml,含内标600 pg/ml),取2.5 ml,加入衍生化试剂3.0 ml以及甲醇∶水试剂10 ml,加热吹干,用水2.5 ml复溶,各取100?l加入到上述吹干的基质中,涡旋混匀,进样分析。
 
  以有基质的待测物峰面积C与对照品溶液经固相萃取、衍生化后直接进样的峰面积D的比值计算基质效应。结果表明,低、中、高浓度样品的基质效应分别为(96.9±7.3)%、(99.9±2.6)%和(102.3±2.7)%,RSD分别为7.5%、2.6%和2.6%(n=6);内标的基质效应为(98.4±4.62)%,RSD为4.6%(n=6)。
 
  2.5.7样品稳定性试验
 
  取1的低、中、高浓度质控样品,分别室温放置12 h、自动进样器中放置35 h、-80℃3次冻融循环、-80℃放置30 d,进行稳定性考察。结果表明,低、中、高浓度样品在室温放置12 h的RSD分别为2.4%、3.5%和2.4%(n=3),自动进样器放置35 h的RSD分别为1.6%、1.3%和1.3%(n=3),-80℃冻融循3次环的RSD分别为0.8%、1.3%和2.5%(n=3),以及-80℃放置30 d的RSD分别为9.2%、3.1%和1.8%(n=3),表明稳定性良好。
 
  2.6药动学应用
 
  采用本法测定12例健康受试者口服1片(1 mg)后血浆中1浓度随时间的变化,结果见图2。主要药动学参数如下:cmax(225.2±16.3)pg/ml,tmax(3.0±1.0)h,AUC0→t(1 890.6±83.1)pg·ml-1·h,AUC(2 026.4±132.7)pg·ml-1·h(n=12)。
  3讨论
 
  3.1高通量样品检测
 
  本试验使用96孔Oasis WAX固相萃取柱配合正压装置,在萃取柱上对血浆样品进行上样、洗脱、衍生化反应。与之前报道使用的固相萃取小柱相比[5],联合使用96孔固相萃取柱与正压装置可同一批次处理更多的样品,实现高通量样品检测。同时,因其柱表面积远小于固相萃取小柱,这大大减少了在上样、衍生化反应、洗脱等过程中样品在柱上的残留,降低了血浆的用量,仅用血浆300?l便可达到10 pg/ml的定量下限,更适用于临床大批量样品的检测。
 
  3.2监测离子对的选择
 
  1甲基衍生化有5个反应位点,响应较高的离子为结合4个甲基的四甲基米诺膦酸(5),m/z 379.2(内标反应后为D4-四甲基米诺膦酸,6)与结合5个甲基的3,m/z 393.2,化学结构式见图3。分别对m/z 379.2和m/z 393.2进行MS2扫描,确定其离子对为m/z 379.2→m/z 253.2和m/z 393.2→m/z 267.1。使用MRM模式检测得上述离子对的保留时间分别为3.49和3.62 min,表明1结合的甲基越多,极性越小,色谱保留越强,其中3的离子对m/z 393.2→m/z 267.1的质谱响应远高于5的离子对m/z 379.2→m/z 253.2,保留时间适宜,故选为监测离子对。
 
  3.3色谱柱的选择
 
  预试验从保留程度、3与其他干扰峰分离度的角度比较了Inertsil C8-3、Waters T3、Eclipse XDB苯基柱等型号色谱柱的分离效果。结果在酸性的流动相条件下,3在Inertsil C8-3柱上无保留;在T3柱上峰形好,但保留时间短,保留时间附近存在内源性物质的干扰;最终选择Eclipse XDB苯基柱作为试验用色谱柱。
 
  3.4衍生化反应条件的优化
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