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液-质联用技术分析体内药物代谢物的研究进展

2020-09-10 09:01 出处:未知 人气: 评论(0
  摘要:现代分析技术快速发展,提供了许多检测药物及其代谢产物的方法。液-质联用技术(LC-MS/MS)凭借其简便、快速的特点成为了代谢物分析中最常用的方法之一。笔者将综合近年来应用LC-MS/MS技术对体内药物代谢物研究的报道,就数据采集及处理、代谢物检测及鉴定、应用软件辅助等过程进行归纳整理。为应用LC-MS/MS技术研究药物的体内代谢过程提供依据。
 
  关键词:药物代谢物;液-质联用技术;代谢物鉴定;软件辅助
 
  药物在生物体内经历的过程有吸收、分布、代谢、排泄。其中药物代谢过程也叫做生物转化,是指药物在药物代谢酶作用下其化学结构及理化性质发生改变的过程。在生物体内,多数药物主要经肝脏进行代谢,代谢产物由肾脏经尿液排出。在临床前或临床药物代谢研究中,整体动物及人体研究反映出的体内药物代谢的整体特征可以提供人体对药物代谢的有用信息。寻找药物的体内活性代谢物是阐明药物疗效物质基础的重要手段,寻找Ⅱ相代谢结合物则可以为研究药物排泄,为解除药物中毒提供理论基础。可见药物代谢物研究在阐明药物药理机制,明确药物发挥活性的物质基础,指导临床合理用药等方面有着积极意义。尿液具有富集作用,所以尿液中代谢物的种类及数量可以反映出生物体内代谢转化的全貌,十分适合作为代谢产物分析的样本。
 
  现代分析技术发展迅速,为药物及其代谢产物分析提供了有力的手段[1-4]。而液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术凭借其简便、快速的特点成为代谢物分析中最常用的手段[5-6]。笔者将对近年来应用LC-MS/MS技术对体内药物代谢物研究分析的过程进行阐述。
 
  1LC-MS/MS技术简介
 
  LC-MS/MS分析技术可以理解为以质谱为检测手段的色谱技术。具有高分离能力的液相色谱可将复杂代谢产物分离,结合质谱提供的结构信息,可避免以往复杂、繁琐、耗时的分离纯化样品的工作,实现对代谢产物快速检测及鉴定。该技术降低了待测物的检测限,具有灵敏度高、选择性强、分析速度快的优势,在鉴定辨识复杂生物样品中微量药物代谢产物时具有极大优势。所以LC-MS/MS分析技术在探讨药物代谢特征、确定药物代谢物结构和代谢途径等方面已被广泛应用且具有广阔的前景。
 
  目前LC-MS/MS技术常规配备高效液相色谱(HPLC)或超高效液相色谱(UPLC)。使用粒径较小的微粒填充色谱柱,在高压下操作,缩短了分析时间。高分辨能力的色谱使峰宽变窄,信噪比增强,提高了分析的选择性和效率,在等度或梯度模式下实现对复杂生物样品的快速分离[7]。
 
  电喷雾离子化(ESI)和大气压化学离子化(APCI)是两种常见的将溶液中分子或离子转化为气相离子的电离方式,为LC/MS常用离子源。ESI常用于极性大、对热不稳定的碱性或酸性化合物的分析,而APCI则更适合于中性或极性小的化合物的分析。
 
  质谱技术近年来发展迅速。离子阱(ion trap,IT)质谱可进行多级质谱(MSn)分析且成本低,灵敏度较高,可用于结构分析,但分辨率较低。由于其质量分析器动态范围较窄,故不宜用于定量测定。四级杆(quadrupole,Q)质谱能提供的质谱数据分辨率较低,但在样品纯度较高,背景不存在无法辨别的杂质干扰时可以提供准确的质量数据[8]。其性能稳定,成本低,可以同时提供定性与定量结果。三重四级杆(triple quadrupole,TQ)质谱在多反应监测(MRM)模式下展现出极高的灵敏度,对于已知化合物可进行定量分析并可以提供相对分子质量及二级碎片信息,常被用作筛选与鉴定药物代谢产物,但对于未知代谢物无法阐释具体结构信息[9]。飞行时间质谱(time of flight,TOF)灵敏度高。全扫描模式下,在一定线性范围内可以提供准确度小于2×10-6的精确相对分子质量,可以帮助确定母离子及碎片离子具体元素组成,用于鉴定未知化合物及同分异构体[10]。四级杆飞行时间(quadru-pole-time of flight,Q-TOF)质谱中四级杆有离子导向作用和质量分选功能,在MS和MS2模式下同时进行分析,结合TOF的高灵敏度,得到母离子和子离子精确的质量数据。具有分辨率高,质量鉴定更加精准和选择性高的特点[11-12]。线性离子阱(quadrupole-ion trap,Q-IT)质谱灵敏度更高,克服了TQ碰撞效率低,定量能力差等缺点,可同时进行定性定量分析,适合于药物小分子代谢物的研究[18]。离子阱飞行时间(ion trap-time of flight,IT-TOF)质谱由可提供多级质谱数据的离子阱质谱和分辨率高,可提供精确的质量数据飞行时间质谱串联而成,该质谱可以通过软件筛选已知代谢物及检测未知化合物[13]。
 
  2药物的体内代谢
 
  药物进入生物体后在药物酶作用下与机体间发生一系列的相互作用结构发生改变,一些药物经代谢失去药理活性后随尿液或胆汁排出体外,也有一些药物通过代谢药理活性增强或产生了毒性代谢产物[14]。因此,药物代谢对药物作用的强弱、作用持续时间、药物治疗的安全性等方面均有不同程度的影响,具有重要的现实意义。
 
  药物体内代谢过程分为I相代谢及Ⅱ相代谢。I相代谢通过氧化、还原、水解、缩合等反应在药物分子结构中引入或脱去功能基团(如-OH、-NH2、-SH等)或药物分子发生缩合、降解等反应,一般生成极性增高的代谢产物。Ⅱ相代谢为结合反应,药物分子中的极性基团通过与内源性物质(如葡萄糖醛酸、硫酸、谷胱甘肽、甘氨酸等)经共价键结合,生成极性大、水溶性高的结合物而经尿液、胆汁排泄。
 
  3LC-MS/MS数据采集方法
 
  LC-MS/MS采用多级质谱数据串联,常见扫描方式有子离子扫描,母离子扫描,中性丢失扫描,多反应监测(MRM)或选择反应监测(SRM)等。
 
  子离子扫描首先通过获得母体药物的子离子谱得到药物骨架的裂解规律,再获得代谢产物的子离子谱并联系生物转化规律及可能的代谢位点,得到代谢产物的可能结构,其适用于分析代谢产物的结构信息。Martin等[15]在分析高哌嗪类化合物(AZX)与甲醛结合后在体内与谷胱甘肽(GSH)的结合位点时,使用LC-UV-MS-MS/MS技术得到AZX的多级质谱数据,再通过检测AZX+13的准分子离子的多级质谱数据得到其具体的反应位点。母离子扫描的目的是追溯子离子碎片的来源,可对产生同种碎片离子的一类化合物进行筛选。
 
  中性丢失扫描通过检测丢失碎片的准确质量来确定原分子中的含有的重要官能团。如检测到18的碎片分子,则证明丢失一分子水(-H2 O)。中性丢失扫描在Ⅱ相代谢物检测方面得到了广泛应用[16]。Yao等[17]检测到半胱氨酸(相对分子质量-121)和乙酰半胱氨酸(相对分子质量-163)的碎片分子,从而确定了土木香内酯的半胱氨酸及乙酰半胱氨酸结合物。Liu[18]和Tian[19]等在研究马钱子碱体内代谢产物时通过中性丢失扫描检测到176的碎片分子(176=葡萄糖醛酸-H2 O)鉴别出马钱子碱的葡萄糖醛酸结合物及脱甲基马钱子碱葡萄糖醛酸结合物。
 
  MRM或SRM可用于分析复杂生物样品中特定的质量数待测物,从而实现对浓度较低的微量代谢成分进行定量分析。Kim等[20]应用LC-MS/MS-MRM模式对酪氨酸激酶抑制剂HM781-36B及其代谢产物进行定量以完成药动学研究。对于原型药物监测m/z 491到354过程,其去甲基产物选择监测m/z 477到340过程。
 
  信息依赖扫描(information depended acquire,IDA)通过事先设定的离子强度、质量数和保留时间等条件进行全扫描、中性丢失扫描、多反应监测等,筛选出符合条件的碎片离子进行多级质谱测定以获得具体的结构信息[21]。Song等[22]对白花前胡素A(PA)的体内代谢物进行检测时应用MRM-IDA-EPI进行数据采集。将质量m/z 245与m/z 227的碎片离子作为PA的特征离子,LightSightTM软件的生物转化预测功能提供MRM离子列表,将IDA程序的阈值设定为500 cps以触发增强子离子扫描(EPI)并在二级质谱中进行MRM监测。该方法相较于其他代谢物检测方法具有更高的灵敏度。
 
  能量相关二级质谱(MSE)为液相色谱串联四级飞行时间色谱。Liu等[23]应用该方法对肿瘤药物SNX-2112及其代谢物进行分析研究,设置低碰撞能量为0 eV进行大范围扫描,得到准分子离子峰以获得样品组分的完整信息。在同样扫描范围下设置20~50 eV的高碰撞能量以获得全部子离子信息。最后通过保留时间、离子强度等信息将母离子与子离子进行关联。该方法通过一次分析即可获得母离子、子离子、中性丢失碎片及其质量数等重要信息[24]。
 
  Afzal等[25]在对抗肿瘤药物ASL代谢产物进行研究时采用多时间段子离子扫描(multi-period product ion scan,mpMS/MS)对数据进行收集。根据ASL及其推测产物的保留时间及相对分子质量等信息,将扫描时间分为4个时间段进行子离子扫描,节省实验时间并提高了灵敏度。由于该方法需要预知保留时间及相对分子质量等信息,因此无法实现高通量筛选。
 
  4LC-MS/MS数据处理方法
 
  空白对照法是最常用的代谢物研究方法。同时设置空白对照组与给药组,筛选在给药组中存在但在空白对照组中不存在的色谱峰,那么该色谱峰所代表的化合物即为可能代谢产物。Yan等[26]对含有多种活性成分的中药方剂四逆散的代谢产物进行了研究。同时设置了甘草苷组,甘草酸组,高、低剂量四逆散组及空白对照组,对比分析其色谱图以筛选出可能的代谢产物。代谢产物在样品中浓度较低,且生物样品中内源性物质对测定会产生干扰,直接从色谱图中筛选原型成分及代谢产物具有一定困难,因此可借助对应于仪器的代谢物查找软件进行筛选。Guo等[27]将两种14 C标记的化合物AZD6280及AZ12488024作为模型药物,通过多种数据处理软件与处理方法相结合的方式对代谢产物进行检测与鉴定。应用Qual Browser of Xcalibur 2.0.7 SP1软件可以分析元素组成,MetWorksTM 1.3则用来完成MDF,背景扣除及组分检测,MZmine version 2.3作为辅助代谢物检测软件。将原始数据按照设定的保留时间及基线强度进行过滤得到新的数据列表。质谱检测模块可产生每次扫描的离子列表,对每一质量离子建立一色谱图,通过解卷积模块将色谱图解卷积为单个峰。应用归一化模块去除系统偏差后对比给药前样品与试验样品产生对齐峰列表,以找出代谢产物所代表的色谱峰。
 
  药物代谢通常在原型药物基础上添加或消去官能团,所以代谢产物通常保留了原型药物的骨架结构,因此认为二者的裂解模式相似,可发生相似的裂解反应,在质谱扫描时会丢失一些相同的中性碎片或形成相同的碎片离子。利用母离子扫描,中性丢失扫描等技术,结合分析药物及代谢产物的MSn谱寻找相同的特征信息,即可找到可能的代谢产物。Jiang等[28]在研究京尼平-1-β-葡萄糖苷(GG)的体内代谢物时,对GG,京尼平苷,京尼平酸的MSn谱进行分析,总结其裂解规律,以此作为GG在大鼠体内代谢物筛选,确定反应位点,结构鉴定的依据,最终在大鼠尿样中发现11种代谢产物。
 
  Bateman等[29]对茚地那韦的代谢物检测时,考虑到药物代谢过程产生的代谢产物的精确质量数变化在几十个毫单位,范围较窄,因此选择应用质量亏损过滤(mass de-tect filter,MDF)设定质量亏损范围,可以使在设定的范围内的代谢物得以保留,并且可以过滤超出该范围的背景离子。
 
  5LC-MS/MS鉴定药物代谢产物结构方法
 
  根据药物代谢产物与原型药物的裂解模式相似及其特异性的裂解规律推导出部分结构,通过与原型药物对比确定具体反应位点。Ramesh等[30]在对胺碘酮代谢产物进行结构分析时分为以下步骤:首先根据已知代谢规律及其他已报道的类似药物的代谢情况对胺碘酮可能的代谢产物进行预测,以确定代谢产物的相对分子质量;对样品进行扫描获得提取离子色谱图,通过对比对照组确定未被预测的代谢物,同时确定其相对分子质量;通过分析代谢产物洗脱顺序,将原型药物与代谢产物的精确相对分子质量列表,计算质量差异等可以推测代谢产物的生物转化类型;最后通过推测的代谢类型设置具体MSn(n=2~4)扫描模式,根据质谱信息确定其具体的反应类型及反应位点。
 
  Attia等[25]应用高分辨率色谱联用离子阱-飞行时间质谱(LC/IT-TOF MS)检测并鉴定广谱抗肿瘤药物Asula-crine(ASL)的体内代谢产物。该研究应用创新的研究策略与代谢物检测软件辅助,通过仪器软件提供的化学式预测,代谢产物检索,检查鉴定代谢产物类型等功能,对已知和未知代谢产物进行广泛检测。Met-ID Solution1.0可比较代谢前和代谢后的样品数据,根据ASL的结构及化学式,获得可能的药物代谢产物结构信息及化学式。IonXtract View则可比较空白样本和处理样本的分子离子,保留时间和峰面积等信息以鉴定未知的代谢物。在使用TOF时将仪器控制语言(ICL)写入相关软件实现分段数据采集功能,不仅增加了目标组分的动态范围,且随着段数的增加而显著改善信噪比。试验中,对原型药物和生物样品分别进行五级质谱和三级质谱分析,获得药物详细的分裂信息。数据处理应用LCMS solutionVer3获得提取离子色谱图(extracted ion chromatograms,EIC)将质量过滤范围设置为30×10-3~50×10-3,应用IonXtract View和Met-ID Solution1.0软件对代谢产物进行结构鉴定并确定其化学式及分裂模式。
 
  Lee等[31]总结了LC-MS/MS技术应用于药物代谢产物鉴定的基本步骤:测定原型药物,获得其MS/MS质谱;对质谱中准分子离子,加合离子及主要的碎片离子进行多级质谱分析,获得原型药物的裂解规律;对样品进行中性丢失扫描,图谱中离子即为原型药物及可能的代谢产物的准分子离子;对主要子离子进行母离子扫描,得到即为代谢产物离子;测定样品所有可能代谢产物的子离子谱,分析谱图以得到代谢物结构。
 
  通过代谢产物与原型药物之间质量数差异可以判断生物转化的类型。常见的有通过中性丢失扫描脱氢葡萄糖醛酸(176)鉴定葡萄糖醛酸结合物;脱氢反应的质量差异为2;乙酰化作用常使代谢产物质量增加42。
 
  一些代谢类型产生的质量数变化大致相同,低分辨率质谱不能区别,如当药物羟基化脱氢(+O-H2)后分子质量增加14,而甲基化药物(+CH2)质量变化也为14,此时需要分辨率更高的质谱来确定其精确质量数变化,如TOF,轨道离子阱质谱(orbitrap)[32],傅里叶变换-离子回旋共振质谱(fou-rier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer,FT-ICRMS)[33]等。
 
  一些代谢反应的质量变化相同,如环氧化作用,羟基化作用,N-氧化作用均使产物质量增加16,此时需要通过其多级质谱数据并借助软件来分析具体反应类型[18]。
 
  6总结
 
  综上所述,LC-MS/MS技术快速、高效,专属性强,准确性高,可用于分析痕量成分,是目前药物代谢研究的首选手段之一[33-36]。不同质谱之间相互联用目前应用十分广泛。液质联用技术已经越来越多应用于药物代谢产物鉴定分析,并与不同研究方法,分析软件联用[37]。
 
  应用LC-MS/MS技术能将复杂生物样品中原型药物及其代谢产物进行高效、快速分离。并通过借助不同的数据处理方法及软件对代谢产物实现检测、识别及鉴定,提高了专一性及灵敏度。相信随着该技术的进一步发展,必将药物代谢研究推向一新高度。
 
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