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药物化学原理与方法研制的达卡他韦

2020-08-04 15:25 出处:未知 人气: 评论(0
  1研发背景和目标
 
  丙型肝炎病毒(HCV)感染由于无法用疫苗预防,对既有的药物又容易产生耐药,因而成为患者预防与治疗的难题。本研究项目开始之前,业界多集中于研制蛋白酶和RNA聚合酶抑制剂,百事美施贵宝公司(BMS)考虑另辟蹊径,从其他的环节或靶标研制新的抗HCV药物,以便联合用药,为疗愈丙肝患者提供新的手段。
 
  1.1干预HCV的蛋白NS5A
 
  HCV是含有9.6 kb基因组的RNA病毒,基因组编码的多聚蛋白有4种结构蛋白和6种非结构蛋白,这些蛋白在HCV进入宿主细胞、复制和出芽等过程发挥不同的作用。非结构蛋白中的NS2和NS3具有蛋白酶活性,催化病毒蛋白的成熟;NS4A是NS3的辅酶;NS4B催化RNA的合成和诱导宿主细胞膜的改变。以这些蛋白作为靶标已有成功的药物上市。非结构蛋白NS5A是含有447个氨基酸残基组成的结合锌离子的磷蛋白,在HCV病毒复制、装配和调节宿主细胞功能以保持慢性感染状态等过程起关键作用,即使没有酶催化功能,这些功能也成为研制药物的靶标(Lemon SM,McKeating JA,Pietschmann T,et al.Development of novel therapies for hepatitis C.Antiviral Res,2010,86:79−92)。BMS公司以此为研制抗丙肝药物的目标。
 
  1.2化学基因组学用于细胞模型筛选——评价活性和毒性
 
  生物学上的基因筛选旨在确定蛋白质功能,是将细胞随机地发生变异,通过筛选生成的突变体所呈现的重要特征,确定特定基因发生的对应突变。新药研究中应用化学基因组学(chemical genetics)类似于生物学的基因筛选,是用细胞筛选小分子化合物库,通过产生重要的表型(phenotype)变化,鉴别相应的靶标蛋白,既寻找苗头或先导物,也确定靶标的功能(Stockwell BR.Chemical genetics:ligand-based discovery of gene function.Nat Rev Genet,2000,1:116−125)。
 
  病毒只能在宿主细胞内复制,理论上讲,抑制病毒的复制由于只干扰被感染细胞的特有病毒蛋白,不会影响正常细胞,但由于化合物或生物大分子的杂泛性(promiscuity),也可能对正常细胞产生影响,所以,目标化合物不应干扰宿主蛋白,以避免毒副作用。
 
  为此,BMS用3种细胞模型分别评价化合物活性、选择性和细胞毒性,即用HCV NS5A的1b基因亚型复制子感染的人肝细胞评价对NS5A活性(GT-1b EC50);用小牛病毒性腹泻病毒(BVDVEC50)感染细胞评价化合物的选择性;还评价化合物的细胞毒作用(CC50)。
 
  2苗头化合物和先导物演化
 
  2.1苗头化合物的发现
 
  BMS公司用高通量筛选方法筛选了一百万个化合物,从中发现一个具有初步活性和选择性的噻唑烷酮化合物(1,GT-1b EC50 0.58μmol·L−1,BVDV EC50>50μmol·L−1,CC50>100μmol·L−1)。但该苗头分子具有明显缺点:分子量较大(MW=587),疏水性过强(clogP>5),有较大的极性表面积(PAS=139Å2),以及噻唑烷酮手性碳的互变异构造成的不稳定性等。因而需要结构改造,演化成先导物(hit-to-lead)(Bell TW.Drugs for hepatitis C:unlocking a new mechanism of action.ChemMedChem,2010,5:1663−1665)。
  2.2氨基酸片段的变换
 
  变换化合物1的结构,母核5-苯基噻唑烷酮所连接的呋喃环、氟苯基亚胺和氨基酸片段都是可变换的部分。首先,将呋喃和氟苯基固定不变,只变换S-丙氨酸片段,表1列出了合成的有代表性的化合物1~6。
  表1中(以及未列出的)化合物构效关系提示,手性Cα的S构型(氨基酸的L构型)活性强于相应的R构型(D构型),大约高1~2个数量级,提示天然氨基酸有利于活性,而且Cα上以连接小体积基团为宜。
 
  进而考察L-丙氨酸和L-脯氨酸的酰基对活性影响,表2的构效关系提示,将苄氧羰基换成苯甲酰基(7和8)或苯丙酰基(11和12)都使活性降低,而苯乙酰基化合物9和10的活性提高大约100倍,9是活性最强的化合物。
  2.3呋喃和氟苯基的变换
 
  变换呋喃和氟苯片段的构效关系提示,呋喃环换成吡啶或吡嗪等极性较强的芳环,显著提高活性,间氟苯基环上若引入高脂溶性基团则降低活性(数据省略)(Romine JL,Laurent DRS,Leet JE,et al.Inhibitorsof HCV NS5A:from iminothiazolidinones to symmetrical stilbenes.ASC Med Chem Lett,2011,2:224−229)。
 
  3活性二聚化合物
 
  3.1噻唑烷酮化学不稳定性的意外发现
 
  深入研究化合物9,发现9的DMSO溶液放置数天后,分子发生氧化重排,生成硫代乙内酰脲(13)以及降解产物硫脲(14)和酮酸(15)。重排和分解的历程推测如图1所示。
 
  由这种不稳定性联想到抗病毒培养液是否也会发生变化,结果发现化合物9在感染细胞培养液中也是不稳定的,然而无论9的降解程度如何,仍然对HCV复制子有强效抑制活性,由这个意外发现推论可能是微量的降解产物(或混合物)具有抑制活性,遂经HPLC分离出两个化合物,抑制HCV复制子活性EC50分别为43 nmol·L−1和0.6 nmol·L−1,其中一个是亚稳定体,加热变成另一个热力学稳定物。经MS和NMR证明是9的二聚物16,MW=1139,EC50为3 nmol·L−1,具有很高活性。还发现16对HCV复制子突变体Y93H也有敏感的抑制活性,而单体9对该变异株活性很弱(EC50>5μmol·L−1)。化合物9生成二聚体的机制推测是在O2作用下拔除C5-H,生成自由基(暂被硫原子和羰基稳定)偶联而成。
  二聚体16对野生型和Y93H突变体都保持高抑制活性,提示抑制剂的药效团呈二聚分布,这为新分子的设计策略提供了新的依据。16成为里程碑式的发现(Lemm,JA,Leet JE,O’BoyleDR,II,et al.Discovery of potent hepatitis C virus NS5A inhibitors with dimeric structures.Antimicrob Agents Chemother,2011,55:3795−3802)。
  3.2二苯乙烯为骨架的二聚体
 
  活性二聚体的发现,联想到靶标蛋白可能以二聚体的形式起作用,后来实验证明HCV NS5A果然以二聚体形式与16相结合(Tellinghuisen TL,Mar-cotrigiano J,Rice CM.Structure of the zinc-binding domain of an essential component of the hepatitis C virus replicase.Nature,2005,435:374−379)。基于药效团原理,推论外端的基团应分别结合于靶标二聚体的结合位点上,这时噻唑烷酮可能是起连接基的作用,未必是参与结合的药效团因素。这个科学假定成为简化化合物16结构的切入点。
 
  最简捷的方法是删除噻唑烷酮和连接的呋喃和氟苯片段。并将L-丙氨酸换成L-脯氨酸(分子简化后可适当增添原子,并且前已证明L-脯氨酸也是高活性片段),得到以二苯乙烷为骨架的化合物17(GT-1b E50 30 nmol·L−1),相对分子质量减少到642。17显示出较高的活性。为降低二苯乙烷骨架的柔性(二聚体16为刚性分子),合成了二苯乙烯化合物18(E50 GT-1a>10μmol·L−1;GT-1b 0.086 nmol·L−1),对GT-1b的抑制活性显著提高。
  3.3对称性药效团的探索
 
  为了考察化合物抑制靶标是否需要对称地结合于相同对应的位点,以18为模板化合物,固定一侧结构,变换另一侧的L-脯氨酸的苯乙酰基或变换脯氨酸片段,合成的化合物及其活性列于表3中。结果表明,苯乙酰基被丙酰基替换,化合物19活性降低200倍,无酰基的20和没有脯氨酸片段的21活性降低到微摩尔级,R为H的游离氨基(22)失去活性。脯氨酸换成丙氨酸片段(23),活性降低10倍,23的苯乙酰基换成乙酰基(24)以及去掉Cα-甲基(25)都使活性显著下降。这一组化合物的构效关系表明:
 
  ①二聚型分子的对称性似乎是必要的(后来用其他骨架证明只要在适宜距离有类似的药效团,非对称分子也可呈现高活性);②脯氨酸片段是优选的;③氮原子须经酰基,酰基尺寸不宜太大等。
  进而对脯氨酸片段的四氢吡咯环作扩环、并环或取代等变换,活性仍以化合物18为最佳(St.Laurent DR,BelemaM,Gao M,et al.HCV NS5A replication complex inhibitors.Part 2:investigation of stilbene-prolinamides.Bioorg Med Chem Lett,2012,22:6063−6066)。
 
  3.4双重抑制剂的研究
 
  为了提高抗HCV效果,要求对GT-1a和GT-1b复制子有双重作用,即泛抑制活性。化合物18虽然对GT-1b有较高活性,但对GT-1a未见活性(EC50>10μmol·L−1)。为了研制有双重作用的泛抑制剂,以对称性二苯乙烯分子18为起始物,系列地改变脯氨酸酰化基团,希望在改变外端的基团或片段中呈现并提高双抑制活性。发现化合物26对GT-1a呈现弱活性(EC50=0.95μmol·L−1),但对GT-1b的活性损失较大。将乙基苯环置换为乙基吡啶(27),氮原子的引入提高了对GT-1b活性。此外,通过比较18与26的最佳构象的苯环与酰基的两面角(分别为−114.6º和−116.6º),相差甚小,推论活性差异不是因乙基的位阻所引起的构象不同所致,可能是增加了疏水性的缘故。
 
  进而将乙基吡啶增加两个碳原子,环合,芳化,变成异喹啉28,此时对两种复制子的抑制活性都有提高,可能是增强了π-π相互作用的缘故。由于萘甲酰的活性很弱,提示氮原子起重要作用。以化合物28为起点作不同的取代,合成了多种取代的异喹啉类似物,优选出化合物29(表4)。
  3.5骨架中双键的变换
 
  与此同时,还研究了二聚物之间不同的连接基对活性的影响。由于反式二苯乙烯化合物在DMSO溶液中可发生trans-cis异构化,因而探索用其他稳定的共轭连接基,如乙炔或芳杂环等。合成有代表性的化合物是外端的脯氨酸片段被N-苯乙酰化和3-氯-5-甲氧基异喹啉甲酰化(因化合物29显示高活性),结果列于表5中。虽然成对的化合物都显示出异喹啉系列的双重抑制活性较高,但因为有细胞毒作用,中止了异喹啉结构类型的研究(Laurent DRS,Serrano-Wu MH,Belema M,et al.HCV NS5A replication complex inhibitors.Part 4.Optimization for genotype 1a replicon inhibitory activity.J Med Chem,2014,57:1976−1994)。
 
  3.6二苯乙炔为骨架的二聚体
 
  二苯乙炔骨架的化学稳定性强于二苯乙烯骨架。为了优化这类二聚物的活性,将前述的构效关系用于二苯乙炔系列的设计上(这种“代入法”有时是成功的)。例如在苯乙酰的α碳上合成含有碱性基团取代的化合物,评价对GT-1a和GT-1b的抑制活性,列于表6中。构效关系表明,该系列呈现双重抗HCV作用,对GT-1b的活性强于GT-1a,手性α碳为R构型的活性高于相应的S构型。其中37和42都有强效的抑制GT-1b活性,但是对GT-1a的抑制作用较弱,为了使两种复制子的抑制活性匹配,需要对拓扑结构作优化调整(Belema M,Nguyen VN,Laurent DRS,et al.HCV NS5A replication complex inhibitors.Part 5:discovery of potent and pan-genotypic glycinamide cap derivatives.Bioorg Med Chem Lett,2013,23:4428−4435)。
  4联苯骨架的先导物及其优化
 
  4.1由酰化的二苯胺乙炔骨架演变为二苯并咪唑乙炔
 
  虽然二苯乙炔骨架的稳定性强于二苯乙烯,但对于GT-1a和GT-1b病毒复制子的双重抑制活性强度差异较大,抑制GT-1a作用较弱,因而需做进一步优化。另外,这类化合物是酰化的二苯胺乙炔,在体内有可能代谢水解生成二苯胺衍生物,会引起基因突变和细胞毒性,呈现特质性药物毒性(idiosyncratic drug toxicity,IDT)。这个问题可通过骨架迁越加以克服。药物分子设计中认为酰化苯胺片段与苯并咪唑之间存在有相似的结构和几何特征,可视作广义的电子等排,因而可以互换。为此合成了以二苯并咪唑乙炔为骨架的分子,有代表性的化合物列于表7。表7的数据提示,将酰基苯胺环合成苯并咪唑,48和49保持了抑制GT1b活性,但对GT-1a活性降低了数10倍,而苯并噁唑化合物50和51对GT-1a未呈现活性。所以,苯并咪唑骨架本身不值得深入研究,但提供了进一步变换结构的思路。

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