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三种达玛烷型皂苷的生物药剂学分类及吸收机制研究

2020-08-04 14:33 出处:未知 人气: 评论(0
  [摘要]目的:探究人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1的生物药剂学分类(BCS)及吸收机制。方法:首先运用StarDrop软件预测三种皂苷的溶解特性及其吸收是否受P-糖蛋白(P-gp)调控,进一步通过实验测定三种皂苷的溶解度,并以Caco-2细胞单层为模型进行双向转运实验,通过研究时间、给药浓度、P-gp抑制剂对模型药物转运的影响,确定其BCS分类及初步吸收机制。结果:人参皂苷Rb1、Rg1为高溶解性药物,三七皂苷R1为低溶解性药物。StarDrop模型预测溶解性与P-gp结果和实际结果存在一定差异。三种药物的表观渗透系数(Papp)均小于14.96×10-6 cm·s-1,为低渗透性药物,在Caco-2细胞单层的转运呈时间和浓度依赖性,Papp(BL-AP)/(AP-BL)均小于1.5。
 
  维拉帕米能降低人参皂苷Rg1和三七皂苷R1的转运速率,对人参皂苷Rb1无影响。结论:人参皂苷Rb1和Rg1为BCSⅢ类药物,三七皂苷R1为BCSⅣ类药物。三种药物均以被动转运为主,且转运不受P-gp调控,同时维拉帕米对人参皂苷Rg1和三七皂苷R1的转运有抑制作用。
 
  [关键词]人参皂苷Rb1;人参皂苷Rg1;三七皂苷R1;生物药剂学分类;Caco-2细胞单层模型;表观渗透系数;StarDrop
 
  达玛烷型皂苷是人参、三七、绞股蓝等中药材的主要药效成分[1]。研究表明,达玛烷型皂苷具有抗肿瘤、改善心肌缺血、免疫调节、降血糖、抗休克、保肝、镇静安神等作用[2-3],具有广阔的应用前景。但是,从天然药物中提取的达玛烷型皂苷大多口服生物利用度低,严重影响了其充分利用[4]。溶解性和渗透性是中药口服药物成药性的核心。因此,探究此类药物的生物药剂学分类(BCS)及转运机制,尽早地发现和解决溶解度与渗透性问题,提高其成药性显得尤为重要。实验参照FDA制定的BCS评价指南[5]及《中华人民共和国药典》2015版凡例中溶解度测定方法[6],测定不同pH下药物的溶解度。通过建立Caco-2细胞单层模型[7],运用较为简单、快速、低成本的体外渗透性试验,评价药物的渗透性并研究其初步的吸收机制。为探究药物的吸收转运与极性的关系[8],实验选择药用价值相对较高的人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1为模型药物。其中达玛烷为母核,人参皂苷Rg1含2个糖基、三七皂苷R1含3个糖基、人参皂苷Rb1含4个糖基,(结构见图1)。对其进行BCS分类研究,为中药新药和剂型的设计提供理论依据。
 
  同时,由于中药单体普遍存在提取率低、成本较高的特点,本实验采用StarDrop软件预测模型药物在水中的溶解特性,并预测药物的吸收是否受P-糖蛋白(P-gp)外排作用影响,与药物实际溶解性及转运实验结果相比较,探究StarDrop模型预测结果的可行性,为其他中药单体性质判断提供一种简单、有效的方法。
  1材料
 
  1.1仪器
 
  INC108型CO2培养箱(德国MEMMERT公司);
 
  SCB-1220型超净台(北京东联哈尔仪器有限公司);Millcell-ERS型电阻仪(美国Millipore公司);Spectra max 190型酶标仪(美国MD公司);Agilent-1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。
 
  1.2细胞
 
  Caco-2细胞(北京协和医学院基础医学研究所细胞中心)。
 
  1.3药品与试剂
 
  人参皂苷Rb1(纯度98.58%,批号MUST-17060106)、人参皂苷Rg1(纯度99.70%,批号MUST-17021414)、三七皂苷R1(纯度98.67%,批号MUST-16112110),均购于成都曼斯特生物科技有限公司;胎牛血清、非必需氨基酸、双抗、0.25%胰酶(Gibco公司);MEM培养基(Hyclone Thermo公司);二甲基亚砜(Sigma公司);磷酸缓冲液(PBS)、HANK'S(Solarbio公司);MTT(Amresco公司);12孔Transwell TM培养板(1.12 cm2,0.4μm,Corning公司);96孔细胞培养板、T-25细胞培养瓶(Corning公司);甲醇、乙腈(MREDA公司)。
 
  2方法
 
  2.1 StarDrop软件预测溶解度
 
  实验运用StarDrop软件中ADME QSAR模型,将受试化合物结构的InChI数据录入,得出化合物在水中的溶解度及是否受P-gp调控。
 
  2.2溶解性实验
 
  2.1.1溶解性测定对于单体化合物,美国FDA工业指导原则指出:在37℃下,pH在1~7.5范围内,剂量/溶解度比值(D:S ratio)小于250 mL的药物为高溶解性药物,即D≤1[5]。本实验根据人体药物吸收部位的pH值及《中华人民共和国药典》2015年版中溶解性的测定方法选取pH 1.2、pH 4.0、pH 6.8、水(pH5.8)四种环境为溶解介质,测定药物在37℃下的溶解性。精密称取化合物过量于离心管中,每个药品各称量四份,分别加入水(pH 5.8)、pH 6.8缓冲液、pH 4.0缓冲液、pH 1.2缓冲液2000μL,置于37℃摇床震摇3 h,30 000 r·min-1离心25 min,取上清液5μL,适当稀释后过0.22μm滤膜,进HPLC测药物浓度,重复三次,按下式计算溶解度及D0值。
 
  D0=(Mo/Vo)/Cs(1)
 
  其中V为250 mL,Cs为溶解度(mg·mL-1),
 
  Mo为人的最大给药剂量(mg)。
 
  2.1.2 HPLC检测色谱条件为Agilent 5 TC C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm)和SEP C18保护柱(8.0 mm×100 mm);进样量20μL,流速1.0 mL·min-1,柱温30℃。流动相:人参皂苷Rb1为乙腈-水(35 6∶5),人参皂苷Rg1、三七皂苷R1均为乙腈-水(23∶77)。
 
  检测波长:均为203 nm。标准曲线、日内精密度、日间精密度、回收率均符合定量检测求。
 
  2.3渗透性实验
 
  2.3.1 Caco-2细胞的培养将Caco-2细胞复苏后培养于37℃、5%CO2、90%湿度的培养箱中。所用培养基为含胎牛血清10%、青霉素-链霉素双抗1%、谷氨酸和非必需氨基酸1%的MEM培养液。隔天换液,培养4~6 d时细胞长至80%~90%,然后进行传代。所用细胞在20~50代之间[9]。
 
  2.3.2药物的细胞毒性实验实验采用MTT法测定药物在Caco-2细胞中的毒性。将1×105个·mL-1的细胞悬液接种于96孔培养板,每孔100μL,培养板边缘填充无菌PBS各100μL。置于37℃、5%CO2、90%湿度的培养箱中培养24 h。吸弃培养液,加不同浓度受试药物100μL(不含胎牛血清培养基配制),其中人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1的给药浓度均为20、40、60、80、100、150、200、300 mg·L-1,每个浓度平行5次,调零组和阴性对照组均加相应体积培养液。培养12 h后,每孔加5 mg·mL-1 MTT溶液20μL(PBS配制),培养4 h后弃去培养液,每孔加150μL DMSO,置摇床震荡10 min,完全溶解后用酶标仪测各孔在570 nm处的吸光值(A),计算细胞抑制率。选取抑制率低于10%的高、中、低三个浓度进行转运实验。
 
  细胞抑制率(%)=[(A对照组-A调零组)-(A实验组-A调零组)]/(A对照组-A调零组)×100%(2)
 
  2.3.3跨膜转运模型的建立将培养至80%~90%的Caco-2细胞按2×105个·mL-1接种于12孔Transwell培养板中,培养板顶侧(AP)加0.5 mL细胞悬液,培养板底侧(BL)加1.5 mL培养液,置于培养箱培养19~21 d,隔天换液。将电阻仪的干燥电极放入PBS溶液中平衡2 h,然后用75%酒精消毒10 min,测量细胞在第19~21 d的跨膜电阻(TEER)。测量时先测空白膜电阻(未接种细胞),再测接种Caco-2细胞的Transwell培养板膜两侧电阻值,相减即为实际膜电阻(△Ω),当TEER值大于500Ω即可用于转运实验。
 
  TEER=△Ω×A(有效膜面积)(3)
 
  2.3.4药物双向转运实验根据细胞毒性实验结果
 
  选择高、中、低三个浓度进行AP→BL与BL→AP侧双向转运实验,探究药物转运与给药浓度及转运时间的关系,实验药物均由HANK'S溶液配制。实验前吸弃两侧培养液,取预热37℃的HANK'S溶液,AP侧0.5 mL、BL侧1.5 mL,各洗涤两次。然后,置培养箱孵育20 min,测膜两侧跨膜电阻TEER,选择电阻值相近的膜孔进行转运实验。对于AP→BL侧的转运:AP侧加0.5 mL药物,BL侧加1.5 mL空白HANK'S溶液,BL侧取样;对于BL→AP侧的转运:BL侧加1.5 mL药物,AP侧加0.5 mL空白HANK'S溶液,AP侧取样。每个药物浓度平行3个复孔,分别于15、30、60、90、120、150、180 min取样200μL,并补加空白预热的HANK'S溶液200μL。实验结束时再次测定TEER值。将样品过0.22μm微孔滤膜后,取20μL进HPLC按2.1.3色谱条件进行含量测定。计算表观渗透系数(Papp)。
 
  Papp=(dQ/dt)/(A×C0)(4)
 
  其中,Papp(cm·s-1)为表观渗透系数,dQ/dt(μg·s-1)为药物单位时间转运量,C(mg·L-1)为药物在供给室的初始浓度,A(cm2)为转运膜面积。
 
  2.3.5 P-gp功能对药物吸收的影响实验选择P-gp抑制剂维拉帕米为参比药物,考察三种皂苷的跨膜转运是否受P-gp外排作用影响。实验组为100 mg·L-1维拉帕米与皂苷合用给药,对照组为不含维拉帕米的受试药物,实验方法同2.2.4中AP→BL侧的转运实验。检测皂苷在各个时间的透过量,计算Papp。
 
  3实验结果
 
  3.1溶解性实验结果
 
  根据溶解性结果可知(见表1),人参皂苷Rb1、Rg在三种pH条件及水中的D均小于1,为高溶解性药物;三七皂苷R1的D0>1,为低溶解性药物。
  3.2药物给药浓度筛选结果
 
  实验结果见表2,细胞抑制率在10%以下的人参皂苷Rb浓度范围为20~200 mg·L-1、人参皂苷Rg安全浓度范围为20~300 mg·L-1、三七皂苷R的安全浓度范围为20~100 mg·L-1。
  3.3时间和给药浓度对药物转运的影响
 
  图2和表3表明,人参皂苷Rb1在AP→BL与BL→AP侧的转运量随着时间的增长而增大,且3 h内未达到饱和,具有时间依赖性。随着药物浓度的增加,转运量随之增加(P<0.05),具有浓度依赖性。AP→BL侧转运速率为7.59×10-6~12.50×10-6cm·s-1,在1×10-6~10×10-6 cm·s-1附近,推测其为中等吸收。AP→BL侧与BL→AP侧,Papp均小于14.96×10-6 cm·s-1,说明人参皂苷Rb为低渗透性药物。高、中、低三浓度的Papp(BL-AP)/(AP-BL)分别为0.94、0.86、1.23,均小于1.5,说明人参皂苷Rb1以被动转运为主[10]。
  图3和表3表明,人参皂苷Rg1在AP→BL侧与BL→AP侧的转运量随着时间的增长而增大,且3 h内未达到饱和,具有时间依赖性。随着药物浓度的增加,同一时间下AP→BL侧转运量随之增加(P<0.05),BL→AP侧无显著变化,说明人参皂苷Rg1在AP→BL侧以被动转运为主。AP→BL人参皂苷Rg转运速率为1.19×10-6~4.17×10-6 cm·s-1,推测其为中等吸收。双侧转运的Papp均小于14.96×10-6cm·s-1,说明人参皂苷Rg为低渗透性药物。高、中、低三浓度的Papp(BL-AP)/(AP-BL)分别为1.12、0.84、0.86,均小于1.5说明人参皂苷Rg1以被动转运为主。
  图4和表3表明,三七皂苷R1在AP→BL与BL→AP侧的转运量随着时间的增长而增大,且3 h内未达到饱和,具有时间依赖性。随着药物浓度的增加,同一时间下AP→BL与BL→AP侧转运量随之增加(P<0.05)。AP→BL三七皂苷R1转运速率为6.98×10-6~10.04×10-6 cm·s-1推测其为中等吸收。
 
  双侧转运的Papp均小于14.96×10-6 cm·s-1,说明三七皂苷R1为低渗透性药物。高、中、低三浓度的Papp(BL-AP)/(AP-BL)分别为0.94、0.88、1.04,均小于1.5说明三七皂苷R1以被动转运为主。
 
  3.4维拉帕米对药物转运的影响
 
  实验结果表明,与对照组相比,实验组的人参皂苷Rb1的转运速率无显著变化(P>0.05),说明人参皂苷Rb1的转运不受P-gp的调控。加入P-gp抑制剂维拉帕米后,实验组的人参皂苷Rg1与三七皂苷R1的转运速率均明显降低(P<0.05),见图5。说明维拉帕米对人参皂苷Rg1与三七皂苷R1的转运具有抑制作用。


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