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荷叶多成分整体的肠渗透性研究

2020-06-23 15:06 出处:未知 人气: 评论(0
  [摘要]中药生物药剂学分类系统(biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica,CMMBCS)研究中,多成分同时测定时需要考虑成分间吸收过程中的相互作用。该研究以荷叶为研究载体,采用离体翻转肠囊实验方法,对荷叶中的多成分在肠道的吸收情况进行研究,并对已知成分进行定量分析。实验表明荷叶提取物中有19个成分可透过肠壁吸收,各成分吸收强弱差异比较大,3个浓度下已知成分荷叶碱的表观渗透系数在1×10-5~1×10-6 cm·s-1数量级,其他已知成分的表观渗透系数数量级分别为芦丁1×10-6~1×10-7 cm·s-1,金丝桃苷1×10-6 cm·s-1,异槲皮苷1×10-6~1×10-7 cm·s-1,紫云英苷1×10-6~1×10-7 cm·s-1,在多成分吸收影响下,几个成分均属于肠渗透性差的成分。这为下一步对不同类别成分分别进行相关靶点研究奠定基础。
 
  [关键词]中药生物药剂学分类系统;荷叶;渗透性;离体翻转肠囊;HPLC
 
  生物药剂学分类系统根据药物的水溶解性和肠渗透性建立了一套科学框架[1],并在不断发展深化中,2015年美国FDA颁布了新版的技术指导原则草案[2],并对原有指导原则作了修订,对研究药物2种属性含义进行重新界定,基本与EMA[3],WHO[4]的相关指导原则保持一致性,也使得相关研究更加规范。对于中药来说,中药生物药剂学分类系统(biopharmaceutics classification system of Chinese ma-teria medica,CMMBCS)[5]在不断借鉴化学药品改进优化同时,还要注重中药的多成分特点,尤其是定量深入研究每个成分的肠吸收性之前,坚持多成分同时测定的原则,在不排除吸收性相互作用的影响背景下,通过定性实验,考察哪些成分可被吸收,哪些成分难以吸收后,再进行具体成分的生物药剂学分类系统中肠渗透性研究。
 
  肠渗透性好的成分,被血液运输到体内靶点发挥药效,而肠渗透性差的成分可在肠腔内充分驻留,有机会与肠腔内的脂肪酶、α-葡萄糖苷酶等靶点充分作用而发挥疗效。因此本研究选择既含有可与肠腔内脂肪酶靶点作用而发挥减肥作用的成分,又含有其他吸收入血成分的荷叶[6-9]作为工具药,通过多
 
  成分整体同时测定肠渗透性的翻转肠囊法,将多成分整体分成易吸收和不易吸收两部分,为后继进一步将两部分分别对应吸收后靶点和吸收前靶点开展研究做准备。
 
  1材料
 
  1.1仪器
 
  LC-20AT高效液相色谱仪(SPD-20A型紫外检测器,SIL-20A自动进样器,日本岛津公司);电子分析天平(BT-25S,北京赛多利斯仪器有限公司);超声波清洗器(KQ-500DE,昆山超声仪器有限公司);电热恒温水浴锅(DZKW-4,北京中兴伟业仪器有限公司);高速冷冻离心机(GL-21M,上海沪湘仪离心机有限公司)。
 
  1.2药物与试剂
 
  荷叶药材购自中国北京同仁堂(集团)有限责任公司,对照品荷叶碱(批号J04 M6 Y1,上海源叶生物科技有限公司)、芦丁(批号Y05 M6 S1,上海源叶生物科技有限公司)、金丝桃苷(批号08916-418,美国ChromaDex)、异槲皮苷(批号HJ0604 XA13,上海源叶生物科技有限公司)、槲皮素(批号Y26 D5 Y1,上海源叶生物科技有限公司)、紫云英苷(批号KS0910 CB14,上海源叶生物科技有限公司)。
 
  乙腈购买于美国Fisher公司(色谱级);磷酸、
 
  氯化镁、氯化钠、磷酸二氢钠、氯化钾、氯化钙、碳酸氢钠、葡萄糖购买于北京化工厂(分析级);娃哈哈纯净水购买于娃哈哈集团公司(中国杭州)。
 
  1.3动物
 
  SD大鼠,雄性,体重200~250 g,斯贝福(北京)实验动物科技有限公司提供,许可证号SCXK(京)2011-0004。2方法
 
  2.1溶液配制
 
  2.1.1对照品溶液制备
 
  分别精密称定荷叶对照品5 mg于10 mL量瓶,以甲醇超声溶解并定容,得到0.5 g·L-1的对照品储备液。分别精密量取1.0 mL各储备液于50 mL量瓶,以甲醇定容,即得10 mg·L-1的混合溶液。
 
  2.1.2 Krebs-Ringer's营养液(K-R液)的制备
 
  称取NaCl 7.80 g,KCl 0.35 g,CaCl2 0.37 g,NaHCO3 1.37 g,NaH2 PO4 0.32 g,MgCl2 0.02 g,葡萄糖1.40 g;加蒸馏水定容至1 000 mL,调节pH为7.39~7.41,放置备用。
 
  2.1.3荷叶提取物溶液的制备
 
  荷叶药材粉碎,得粗粉,称取5 g,以60%乙醇固料比1∶30回流提取1 h,提取液趁热抽滤,放冷定容至250 mL,摇匀,过0.45μm微孔滤膜,取续滤液供HPLC分析。
 
  2.1.4肠渗透药液的制备
 
  荷叶药材粉碎,得粗粉,以60%乙醇固料比1∶30回流提取1 h,提取2次,提取后趁热抽滤,合并2次提取液,以旋转蒸发仪减压回收溶剂至接近浓浸膏状态,60℃水浴直接干燥无醇味时,加K-R营养液制成一定浓度药液,过0.45μm微孔滤膜,取续滤液供HPLC分析。
 
  2.2荷叶多成分HPLC分析方法的建立
 
  2.2.1色谱条件
 
  采用Phenomenex Gemini C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),检测波长270 nm,流速0.8 mL·min-1,柱温30℃,进样量20μL,流动相0.025%磷酸-乙腈进行梯度洗脱(0~2 min,98∶2~98∶2;2~5 min,98∶2~92∶8;5~8 min,92∶8~92∶8;8~11 min,92∶8~88∶12;11~17 min,88∶12~88∶12;17~25 min,88∶12~85∶15;25~43 min,85∶15~85∶15;43~61 min,85∶15~74∶26;61~70 min,74∶26~74∶26;70~89 min,74∶26~25∶75;89~90 min,25∶75~25∶75;90~98 min,25∶75~98∶2;98~120 min,98∶2~98∶2)。
 
  2.2.2定量分析方法学考察
 
  为了了解可标定成分肠渗透情况,获得肠吸收成分表观渗透系数,对荷叶中可标定成分进行方法学考察。
 
  2.2.2.1线性关系考察分别量取一定体积0.5 g·L-1的对照品储备液于量瓶中并定容,配成0.05,0.5,1.0,4.0,10.0,20.0 mg·L-1的对照品混合溶液,分别进样分析,记录峰面积。
 
  2.2.2.2专属性考察分别进样K-R空白液、混标溶液以及样品溶液,对照品各峰出峰处没有干扰,见图1。
  2.2.2.3精密度考察混标溶液连续进样5针,记录各峰峰面积,隔日重复操作。考察日内、日间精密度,结果显示日内、日间峰面积RSD小于2.0%。
 
  2.3荷叶离体翻转肠囊法多成分肠渗透定性研究健康SD大鼠禁食不禁水12 h,水合氯醛麻醉,
 
  小心将肠管同肠系膜剥离,分别取各段小肠约10 cm,放入37℃的生理盐水中,并冲洗至无内容物流出。小心剥离肠段表面的肠系膜和脂肪,将肠管一端结扎于自制塑料套管,小心将肠管翻转,向肠囊内注入1 mL空白K-R液,结扎另一端,放入37℃恒温的药液中,通入氧气。温孵1 h后将肠囊取出,擦净表面液体,倾出液体。样品于13 000 r·min-1离心15 min后,小心取上清液低温保存,同时供HPLC分析,记录峰面积,依据公式计算肠渗透性表观吸收系数
 
  其中,ΔQ/Δt为60 min内肠囊内药物成分质量的变化率,μg·s-1;L为含药肠囊长度,cm;C为温孵时药液初始质量浓度,mg·L-1。
 
  3结果
 
  3.1荷叶多成分HPLC图的建立
 
  3.1.1荷叶多成分HPLC图
 
  为了考察荷叶成分吸收变化情况,本研究建立了荷叶化学成分HPLC图,各对照品处没有干扰,结果见图1。
 
  3.1.2标准曲线绘制
 
  以药物质量浓度X(mg·L-1)为横坐标,峰面积Y为纵坐标,进行线性回归,见表1。结果表明各对照品在相应浓度范围内线性关系良好。
  3.2荷叶多成分肠渗透性研究
 
  3.2.1荷叶多成分总体肠渗透性定性研究
 
  荷叶成分以黄酮类成分、生物碱类成分居多,多成分色谱洗脱峰主要集中在中间及后半部分,从而避开了肠液的干扰,荷叶多成分肠吸收定性分析结果见图2,从图谱中可以看出原药材可检测的24个成分中,除了成分4,9,11,13,23当前色谱条件下未见检出外,其他成分在各肠段均有吸收,但吸收的程度有差别。
 
  3.2.2荷叶可定量多成分肠渗透性定量研究
 
  采用荷叶可定量成分肠吸收系数见表2,图3,由此可看出,5种可标定成分肠渗透性较差,在不同的肠段渗透能力有差异,荷叶碱成分在肠道吸收较强,P在3个不同生药浓度下在1×10-5~1×app10-6 cm·s-1数量级,芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷等黄酮苷类成分吸收渗透系数偏低,大致在1×10-6~1×app2πrLC010-7 cm·s-1数量级,紫云英苷在肠段吸收相对较好,其渗透系数在1×10-6 cm·s-1数量级。荷叶中多成分环境下,荷叶碱在各肠道吸收最好。

  4讨论
 
  4.1荷叶成分肠渗透性模型的选择
 
  翻转肠囊法是既简单又有效的肠渗透研究方法,从1954年提出后便开始用于药物成分肠吸收能力的评价工作[12-13]。离体方法操作简便,结合高效液相指纹图谱方法,可以直观、快速有效地分析并锁定中药中可透膜吸收以及不能吸收的化学成分。同时翻转肠囊模型尽可能的保持了肠壁原有的组织和粘膜特性,使得该模型还可用来研究影响吸收的肠壁外排蛋白以及代谢等因素[14-16],因此本实验选择翻转肠囊法作为研究方法进行成分肠渗透性研究。
 
  4.2多成分环境下荷叶已知成分肠吸收情况
 
  多成分环境下,成分在肠道过程中相互作用影响其他成分的吸收。本实验结果显示,荷叶碱肠渗透性强于其他已知成分,这与文献报道部分成分一致[17-19],但是,由于这些成分在不同肠道的吸收情况有所差异,考虑为多成分环境下成分影响导致[5]。除了荷叶中吸收成分外,还检测出含量较高的成分X1,此成分在原药的K-R液中检测含量极低,而此成分与对照品紫云英苷出峰时间一致,因此初步认为此成分可能是槲皮素,同时荷叶成分在肠液中稳定性试验也发现,成分18也出现降解,考虑可能是肠壁酶代谢的结果。
 
  5展望
 
  荷叶中除了存在吸收入血发挥药效成分,还存在以吸收前机制发挥作用的成分,多成分环境下成分间的相互作用也会对单一成分的肠吸收产生影响。本研究以荷叶中多成分整体为研究对象,在多成分环境下对其中的成分进行肠渗透性研究,由于对照品的匮乏,选定了其中的6个成分进行定量分析,测定其渗透系数并评估其渗透性,为后续关联药效成分靶点奠定基础。在中药生物药剂学分类系统的进一步研究中,吸收差成分可以借助吸收前靶点探讨荷叶多成分与药效靶点的关系,对吸收入血的成分探讨其与吸收后靶点的关系。
  [参考文献]
 
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