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关于 Caco-2 细胞单层渗透性测定评价标准的共识性建议

2020-06-17 14:44 出处:未知 人气: 评论(0
  摘要:Caco-2细胞单层是评价体外药物渗透性最常用的模型,需进行验证与标准化。本文旨在结合相关指导原则,通过广泛调研文献数据,并针对关键技术要点与业内专家进行深入探讨,就Caco-2细胞单层渗透性测定评价标准达成共识性建议,供制药企业及监管部门参考。
 
  关键词:Caco-2细胞;渗透性测定;生物药剂学分类系统;人体生物等效性豁免;标准
 
  Caco-2细胞(the human colon carcinoma cell line)是一种人类结肠腺癌细胞。经过培养,Caco-2细胞单层分化出绒毛面顶侧和基底面基底侧,表现出细胞极性,且具有明确界定的顶端刷状边缘和紧密的细胞间连接,形态学上类似小肠吸收细胞。由于采用Caco-2细胞单层测定药物渗透性的方法较简单且重复性好,已被广泛用于评估药物在人体肠道的渗透吸收[1—5]。但是,Caco-2细胞单层测定药物渗透性的试验尚无标准化的验证与测定方法,对Caco-2细胞单层测得数据的评价和技术审评造成了一定困扰。
 
  为使Caco-2细胞单层渗透性测定评价标准达成共识性建议,本文结合国内外相关指导原则,通过广泛调研文献数据,就关键技术问题进行探讨。
 
  1适用范围
 
  药物跨肠上皮细胞转运主要通过4种途径:被动转运、细胞旁路转运、载体转运及巨胞饮作用。由于存在外排转运体和摄取转运体低表达或无表达的可能,因此将Caco-2细胞单层模型用于评价被动转运药物的膜渗透性更可靠。
 
  2Caco-2细胞单层模型的建立
 
  采用常规细胞培养方法,将Caco-2细胞进行接种和传代。建议各实验室结合内标化合物(通常为低、高渗透化合物及已知外排转运体的底物),确定合适的接种天数(通常为21~28 d)和细胞传代数。
 
  3验证Caco-2细胞单层渗透性测定方法的可靠性
 
  在采用Caco-2细胞单层测定药物渗透性之前,应充分验证该测定方法的可靠性。
 
  3.1Caco-2细胞单层完整性的验证
 
  通过验证细胞形态学以及测定跨膜电阻、碱性磷酸酶活性等方法考察Caco-2细胞单层的完整性。
 
  3.1.1细胞形态学检查
 
  将培养好的Caco-2细胞单层置光学显微镜下观察,细胞应均匀、致密、边界清晰。
 
  3.1.2跨膜电阻的测定
 
  通过细胞电位仪测得的跨膜电阻来评价细胞单层模型的完整性[6],电阻值越大,说明细胞单层越致密。而不同实验室的培养条件不同,实验室间的细胞单层跨膜电阻不具可比性。可以通过以下2点建立各实验室跨膜电阻低限值:①Caco-2细胞单层跨膜电阻在建模后是否稳定增长;②细胞旁路转运标志物,如甘露醇等的表观渗透系数(Papp)是否呈现低渗透特点[6—8]。
 
  3.1.3碱性磷酸酶活性的测定
 
  Caco-2细胞单层在不同时间段的绒毛面顶侧和基底面基底侧的碱性磷酸酶活性可反映Caco-2细胞单层的生化特性及细胞极性。碱性磷酸酶主要分布在绒毛面,可以使用碱性磷酸酶试剂盒等方法来测定其活性。
 
  3.2Caco-2细胞单层功能性表达的验证
 
  介导药物外排的转运体主要包括P-糖蛋白(P-glycoprotein)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated proteins)、乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein)等。在非饱和浓度下,通过双向转运研究证实所选外排转运体底物(例如地高辛、长春碱、罗丹明123)的非对称渗透性,可用来证明外排转运体的功能性表达。如以地高辛为外排底物时,通过测定在含有或不含有外排转运体抑制剂环孢素A的情况下底物的Papp及外排比,可评估Caco-2细胞单层中外排转运体的功能性表达。
 
  3.3模型化合物渗透系数的测定
 
  使用零、低(<50%)、中(50%~84%)和高(≥85%)渗透性的模型药物,通过分析试验所得的Papp与文献报道的人体药物吸收程度间的相关性,来证明Caco-2细胞单层渗透性测定的适用性。建议使用足够数量的模型药物进行验证,以表征完整的渗透率范围(建议低、中和高模型组中每种渗透性类别至少为5个,一共不少于20个模型药物)。此外,应采用足够数量(至少3个)的平行细胞分析样本,以可靠地评估药物渗透性。建立的相关性应能区分低、中和高渗透性药物。
 
  许多药物在Caco-2细胞单层试验中的渗透性易受pH值的影响。为了尽量减少假阴性结果的出现(即将非低渗透性药物归类为低渗透性药物),可以使用顶侧不同pH值条件[低pH值(6.5)和高pH值(7.4)]模拟肠道中的动态pH值环境来测定药物渗透性[8—9]。对于少数化合物,如有必要,可开展在体肠灌流等试验进行补充。
 
  3.4内标化合物的确定
 
  内标化合物的选择应基于其与受试药物的相容性,不应表现出任何显著的物理、化学或渗透相互作用。选择渗透性接近中、高渗透性界值的高渗透性内标化合物时,如结果表现为受试药物渗透性等于或大于所选高渗透性内标化合物,则认为该受试药物具有高渗透性。
 
  4Caco-2细胞单层渗透性试验数据的处理与评价
 
  4.1Caco-2细胞单层渗透性试验数据的处理
 
  进行Caco-2细胞单层渗透性试验时,应选择合适的药物浓度,如在250 ml溶剂中分别溶解最高单次给药剂量0.01、0.1和1倍的药物,设置3个浓度组。每个浓度做3个平行。待测物的渗透性信息(均值、标准差、变异系数)应包括待测物的Papp和回收率等,Papp和回收率的计算公式分别见式①和式②[10]。
 
  Papp=(dcr/dt)×Vr/(A×c0)式①式中,dcr/dt为接收室累积浓度随时间变化所得直线的斜率/?mmol·L-1·s-1;V为接收室容积/cm3;A为细胞单层面积/cm2;c为待测物初始浓度。
 
  回收率%=100×[(V×c final)+(V×c final)]/(V×c)式②式中,V为供体室容积/cm3;c final为孵育末期接收室累积浓度/?mmol·L-1;c final为孵育末期供体室浓度/?mmol·L-1。对于回收率小于80%的情况,应进行质量平衡评价,包括测定药物的膜残留量。
 
  此外,外排比也是一项重要的待测物渗透性信息。在临床剂量范围内,当药代动力学中AUC和cmax参数与剂量成比例时,可以推断其为被动转运机制,同时也可以使用已知外排转运体的测定系统来验证药物转运中不存在主动转运机制,例如,通过证明体外Papp不依赖初始药物浓度或以外排比判断转运方向,即对于所选药物浓度,基底端到顶端Papp,B→A和顶端到基底端Papp,A→B的比值小于2。
 
  4.2Caco-2细胞单层渗透性测定方法的验证报告
 
  Caco-2细胞单层渗透性测定所用分析方法的最终验证报告应包括研究编号、题目、目的、测试分析场所及地址(渗透性实验室及生物分析实验室)、研究日期、原始资料存储地址、待测物名称、内标化合物、分析方法、标准曲线范围、定量限度、质控样品及稀释质控样品(如果需要)的浓度、药物(内标化合物及待测物)在顶端到基底端及基底端到顶端的平均Papp和平均回收率、药物的外排比、标准操作规程等信息。此外,还应包括所用模型药物及人体吸收程度数据、渗透性分类等,并确定低、高渗透性分类临界值和用于试验药物分类所选的内标化合物等相关信息,这样有利于申请人进行规范化的研究与申报,以及相关监管部门的审批。
 
  5总结
 
  Caco-2细胞单层作为体外评价药物渗透性的最常用细胞模型,其方法验证与测定须进行标准化,以便于申请人进行规范化的研究与申报以及相关监管部门进行审批。本文参考了国内外相关指导原则以及部分已公开的基于生物药剂学分类系统(BCS)分类的人体生物等效性豁免审评报告,并充分借鉴了业内相关专家的建议,形成了关于Caco-2细胞单层渗透性测定评价标准的共识性建议,供业内参考。
 
  参考文献:
 
  [1]HILGERS A R,CONRADI R A,BURTON P S.Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinalmucosa[J].Pharm Res,1990,7(9):902-910.
 
  [2]NATOLI M,LEONI B D,IGEA D,et al.Good Caco-2 cellculture practices[J].Toxicol In Vitro,2012,26(8):1243-1246.
 
  [3]ARTURSSON P,PALM K,LUTHMAN K,et al.Caco-2 monolayers in experimental and theoretical predictions of drug transport[J].Adv Drug Deliv Rev,2012,46(1-3):27-43.
 
  [4]LEE J B,ZGAIR A,TAHA D A,et al.Quantitative analysisof lab-to-lab variability in Caco-2 permeability assays[J].Eur J Pharm Biopharm,2017,114:38-42.
 
 [5]SEVIN E,DEHOUCK L,COSTA F D,et al.Accelerated Caco-2 cell permeability model for drug discovery[J].J Pharmacol ToxicolMethods,2013,68(3):334-339.
 
  [6]蔡润兰,王敏,齐云,等.Caco-2细胞模型验证指标的选择与评判[J].中国药学杂志,2008,43(24):1871-1875.
 
  [7]孙敏捷,盛星,胡一桥.Caco-2细胞单层模型的建立与验证[J].中国药学杂志,2006,41(18):1431-1434.
 
  [8]高坤,孙进,何仲贵.Caco-2细胞模型在口服药物吸收研究中的应用[J].沈阳药科大学学报,2005,22(6):469-474.
 
  [9]余自成,高瑜,田薇薇,等.肠道转运Caco-2细胞单层模型的建立及验证评价[J].中国临床药学杂志,2012,21(4):218-221.
 
  [10]ALLEN T H,ADAM B,ANDY W,et al.Discovery of selective toxoplasma gondii dihydrofolate reductase inhibitors for the treatment oftoxoplasmosis[J].J Med Chem,2019,62(3):1562-1576.
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