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单向在体肠灌流在中药研究中的应用

2020-04-02 11:31 出处:未知 人气: 评论(0
  [摘要]化合物的溶解性和渗透性在评价候选药物的口服吸收及生物药剂学分类系统占有重要地位,基于中药多成分特点,所提出的中药生物药剂学分类系统更适用于中药成分的研究。谱效相关技术的普及为寻找中药药效物质成分提供了新方法,而以肠吸收谱为切入点,避免了血清谱复杂的体内分布、代谢过程带来的难题,且不易遗漏不吸收的有效组分,更加简便,更适用于复方药效物质基础的研究。单向在体肠灌流模型是公认的研究药物在体吸收的模型,在一定程度上准确模拟了口服药物的在体吸收,联用运用肠系膜取血等技术,可较为真实反映成分吸收入血情况,更加适用于中药生物药剂学分类系统及谱效相关的研究,值得注意的是,单向在体肠灌流实际上反映的是各组分表观吸收,欲进一步了解其吸收机制,还需结合单个药物、成分的单向肠灌流研究及在体吸收研究。在单一成分研究的基础上,再对其多成分环境下的特征和规律进行研究,回归到以中药或复方为整体的研究中去。近年来,单向在体肠灌流在中药研究中应用越来越多。查阅近20年文献,对筛选出用于中药研究的200多篇文献进行分析,结合课题组经验,总结其在中药有效成分、单味药、药对、复方研究中的应用及使用时的注意事项,为其在中药研究中的进一步应用提供参考。
 
  [关键词]单向在体肠灌流模型;肠吸收;中药多成分
 
  口服给药是中药最主要的传统给药方式,肠吸收是其最主要的吸收途径。研究药物口服后肠道的吸收情况对评价药物的生物利用度、改进药物的剂型、提高疗效具有非常重要的意义。以生物药剂学分类系统的科学框架为基础建立的中药生物药剂学分类系统(CMMBCS),从中药多成分吸收角度,研究多成分环境下的中药特征指标成分的药物吸收特征,辅以谱效相关研究方法,以肠吸收谱为切入点,有效避免了血清谱效相关中复杂体内动态过程带来的困难,为研究中药疗效物质基础,阐明中药复方的配伍机制,理解中医药理论的科学内涵提供了新思路[1-2]。
 
  上述研究中常用的单向在体肠灌流模型(single-passintestinalperfusion,SPIP)1986年首次应用于药物吸收研究[3],是公认的研究药物吸收代谢的有效模型,同时也是FDA认可的生物药剂分类学中研究药物与候选药物吸收特征的模型之一[4]。通过对近20年的国内外文献分类整理,发现SPIP主要用于中药单个有效成分、多个有效成分、复方药对等方面的研究,并总结应用SPIP时的注意事项,以供同道参考。
 
  1中药单个有效成分的研究
 
  中药有效成分的胃肠转运研究一直是SPIP的研究热点之一。研究成分吸收的最佳部位,弄清pH,浓度,P-gp蛋白抑制剂、吸收促进剂等对成分吸收的影响,对成分新剂型的开发有重大指导意义。国内外的文献报道中,以生物利用度低的苷类和黄酮类成分研究居多,如黄酮苷类淫羊藿苷[5],黄芩苷[6],牡荆素[7],芍药苷[8],蒙花苷[9],毛蕊异黄酮葡萄糖苷[10],田蓟苷[11],高车前苷[12],金丝桃苷[13]等;皂苷类(20)-原人参二醇[14],白头翁皂苷D[15],积雪草苷[16],续断总皂苷[17],黄芪甲苷[18],薯蓣皂苷[19],灵仙新苷[20],刺五加皂苷B[21]等;强心苷类杠柳毒苷[22],杠柳次苷[23],地高辛[24]等;此外,还有连翘脂苷A[25],红景天苷[26],丁香苦苷[27],牛蒡子苷[28]等。黄酮类如葛根素[29],木犀草素[30],芹菜素[31],水飞蓟素[32],川陈皮素[33],灯盏花乙素[34],芫花素[35],甘草素[36],异甘草素[37],汉黄芩素[38],柚皮素[39]等。生物碱类如盐酸小檗碱[40],乌头碱[41],黄连小檗[42],巴马汀[42],黄连碱[42],表小檗碱[42],药根碱[42],胡椒碱[43],苦参碱[44],氧化苦参碱[45],青藤碱[46],盐酸麻黄碱[47],拉马宁碱[48],茶碱[49],秋水仙碱[50],羟基喜树碱[51]等。醌类如大黄酸[52],芦荟大黄素[53],隐丹参酮[54],丹参酮IIB[55],大黄素[56],紫草素[57],大叶茜草素[57]等。萜类如紫杉醇[58],穿心莲内酯[59],齐墩果酸[60],补骨脂酚[61],雷公藤甲素[62],熊果酸[63],灵芝三萜[64]等。苯丙素类如绿原酸[65],补骨脂素[66],瑞香素[67],秦皮甲素[68],蛇床子素等[69],研究涉及成分种类众多。主要集中在已知有效成分,水溶解度低、口服吸收差成分,以及紫杉醇等价格昂贵,急需提高生物利用度、开发合适新剂型的成分。运用SPIP模型,饶小勇等[15]考察了吸收部位,药物浓度,P-gp蛋白抑制剂和pH对白头翁皂苷D吸收的影响,发现各肠段的Ka和Papp为结肠>回肠>空肠>十二指肠,说明其吸收主要部位为结肠;不同质量浓度的灌流液在结肠的吸收无显著差异,初步确立其为被动扩散;加入维拉帕米后其吸收明显增加,证明为P-gp底物;白头翁皂苷D为弱酸性化合物,随着pH的增高,易成盐,增大溶解度,Ka和Papp值不断增加,为使用制剂手段增加其溶解性提供了依据。王婷婷等[11]考察了不同蛋白抑制剂对田蓟苷在大鼠空肠段吸收的影响,发现加入维拉帕米、利血平后,其在空肠的Ka和Papp显著增加,加入根皮苷后其空肠Papp显著降低,而利福平对其没有显著影响,推测P-gp和乳腺癌耐药蛋白(BCRP)外排机制可能是其口服生物利用度低的原因,加入可抑制上述蛋白作用的药物和辅料,为提高其生物利用度指明了方向。
 
  卫世杰等[70]考察了促吸收剂对水飞蓟宾及其磷脂复合物肠吸收的影响,发现其形成磷脂复合物后在各肠段的吸收都有增加,聚山梨醇酯对水飞蓟宾及其磷脂复合物无明显促进吸收作用,甘胆酸钠和卡波姆有较弱的促进吸收作用,十二烷基硫酸钠对水飞蓟宾具有较强的促进吸收作用,而对其磷脂复合物作用较弱,聚氧乙烯氢化蓖麻油对水飞蓟宾和磷脂复合物均有较强的促进吸收作用,为剂型设计和辅料选择提供参考。还有部分学者对黄酮的肠代谢机制进行了研究,如范艳芳等[71]在野黄芩素FVB/NCrlVr小鼠磺酸化代谢特征研究中发现野黄芩素在体内不同肠段的存在不同的代谢反应特征,提示某些药物成分在灌流过程中可能被肠道内细菌或酶代谢,需引起注意。
 
  SPIP在药物新剂型评价中占有重要地位。Wu等[72]发现将黄芩苷制成磷脂复合物自乳化微乳剂后其Peff值明显增加,更易于人体的吸收。Zhang等[5]发现经环糊精包合后的淫羊藿苷的肠道吸收明显增加,而羟丙基β-环糊精由于其P-gp抑制作用吸收更多。Shao等[73]将胡椒碱制成自乳化微乳剂后,无论是在体内药代动力学或是SPIP模型中,胡椒碱的相对生物利用度、相对渗透率明显提高,从另一方面也说明了SPIP与体内模型具有较好的相关性。
 
  2中药多个有效成分的研究
 
  近年来有采用多元分析方法分析多成分在吸收中的相互作用的报道。吴青青等[74]联用SPIP和颈静脉插管取血、胆囊结扎技术,结合灌流液、胆汁、血样及肠道酶共孵育实验分析甘草主成分及提取物的吸收特征,发现甘草提取物中其他成分能够促进甘草苷的吸收,但对甘草酸无显著的影响,血液、胆汁以及肠道酶共孵育实验未见到甘草苷、甘草酸及代谢产物,可能在试验时间内,甘草提取物中其他成分未能提高这两种成分吸收入血、胆汁中的含量。Li等[75]联用SPIP技术和Caco-2细胞模型发现黄芩素、汉黄芩素、木蝴蝶素混合给药能够促进三者在小肠的吸收,并减少Ⅱ期代谢。You等[76]联用SPIP技术和Caco-2细胞模型,研究肠道微生物群以及转运蛋白对于黄芩素和野黄芩素吸收的影响,发现P-gp、多药耐药相关蛋白以及BCRP蛋白均能抑制影响野黄芩素的吸收,加入上述转运蛋白的抑制剂后促进了野黄芩素的吸收以及野黄芩素转化为黄芩素,从而影响黄芩素和野黄芩素的比例,影响治疗效果,对临床用药具有一定的指导意义。
 
  3中药复方的研究
 
  3.1复方物质基础蔡凝芳[77]运用SPIP研究补肺活血胶囊中黄芪的物质基础,分析灌流液中主要成分减少情况,并结合大鼠在体模型,分析吸收入血成分及尿液中成分,确定毛蕊异黄酮、芒柄花素和黄芪总皂苷为主要有效成分,并进行成分优化提取、纯化工艺,为深度研究补肺活血胶囊奠定基础。
 
  3.2 药对配伍作用 Liang等[78]分别以外翻肠囊法和SPIP研究白芷黄芩配伍后黄芩苷的吸收变化,发现白芷提取物能显著提高黄芩苷的吸收,其促吸收作用与抑制P-gp蛋白无关,黄芩苷可通过β-葡萄糖醛酸酶水解为黄芩素而被吸收,结肠内该酶数量高于十二指肠,但白芷的促吸收作用主要表现在十二指肠,其相互作用机制有待进一步探索。Zhang等[79]同样以外翻肠囊法和SPIP研究附子甘草配伍后的成分吸收变化,发现乌头碱、次乌头碱、新乌头碱3种生物碱在配伍后能够快速溶出并吸收入血,为酸-碱药对的配伍机制研究提供了新思路。
 
  3.3 复方配伍作用 葛根芩连汤[80]不同配伍组主要成分的肠吸收特征研究发现甘草可促进葛根中葛根素和大豆苷的吸收,葛根也可促进甘草苷的吸收。黄芩苷与汉黄芩苷在全方及不同配伍组的吸收情况表明,葛根和甘草可促进黄芩苷的吸收,且葛根的作用强于甘草;葛根同样可促进汉黄芩苷的吸收,但甘草对其则为抑制作用。葛根与甘草均可促进黄连有效成分药根碱、小檗碱和巴马汀的吸收。汪汀等[81]以栀子苷为主要指标成分,研究栀子厚朴汤方剂配伍的合理性,发现经枳实、厚朴配伍后,栀子苷的吸收显著增加,为该方剂的配伍合理性提供依据。
 
  此外,部分学者对复方中药间不同配比对各成分吸收的影响进行了探索。涂瑶生等[82]以吴茱萸碱、吴茱萸次碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱为主要指标成分,研究黄连吴茱萸不同配比的在体肠吸收,发现黄连和吴茱萸无论单煎或不同比例组方各成分在各肠段均有吸收,在黄连-吴茱萸为1∶1和6∶1时于空肠和回肠较易吸收,黄连-吴茱萸为2∶1时于回肠较易吸收。
 
  4模型制备与注意事项
 
  通过对上述文献进行整理学习,结合课题组前期实验,对SPIP实验注意事项进行总结,以供参考。
 
  4.1水分校正灌流液一般采用K-R液作为基质。由于小肠不仅吸收药物也吸收或分泌水分,使灌流液的体积发生变化,从而导致药物浓度的变化,因此需进行水分校正。目前水分校正方法有14C标记法、酚红法、质量法。14C标记法由于其操作复杂性及安全性问题较少被采用[83]。酚红长期被用来校正灌流液水分变化。但有文献报道,酚红会被小肠吸收,其平均吸收率为6%[70],肠吸收速率为(3.18±0.27)%·h-1[84],用其校正灌流液体积时可导致Ka为负值。因此有学者认为对于吸收较好的药物,由酚红带来的误差对实验结果影响并不明显,可忽略不计;但对于难吸收的成分,如葛根素等,酚红的吸收有可能带来极大的影响[85]。此时,需考虑采用质量法校正。SuttonSC等[83]分别以14C标记法、酚红法、质量法校正水分,发现质量法校正后的平均水通量是14C标记法、酚红法的2倍,且变异系数小、更准确,更适合作为SPIP的水分校正方法。与质量法相比,改良质量法从灌流液中抽取固定体积称量,测定密度,进而校正体积,消除了由于肠道的分泌、黏膜脱落以及药物被吸收等原因导致的药物吸收前和吸收后密度改变的因素,更加准确可靠[86]。
 
  但是课题组研究发现:是否采取水分校正及采用何种水分校正方法尚需考虑成分对肠道水分分泌或肠道蠕动的影响。如进行芍药甘草汤的SPIP研究中发现,单位时间内流出液的体积均比灌流进的体积有所增加,究其原因可能是白芍可促进小肠和大肠的推进运动,并使小肠大肠中水量增多有关[87]。此现象在吴茱萸汤的SPIP研究中同样出现,唐映红等[88]对吴茱萸汤的温脾止泻作用进行研究,发现其能抑制小肠的推进运动,促进肠道对水分和电解质的吸收。因此,水分校正方法选择对结果的影响需要重视。
 
  4.2灌流液pHpH分配学说认为药物的吸收取决于药物在胃肠道中的解离状态和油水分配系数[89],人体肠道的pH通常在6~8,很难低于5.5[90],同一成分在不同pH环境中的溶解度、解离度、稳定性等有很大差别,因此确定合适的灌流液pH值对研究成分的肠道吸收特征尤其重要。复方中众多成分性质不一,筛选pH值时需考虑对各成分的稳定性和解离程度的影响。
 
  4.3中药复方灌流液制备中药复方由于所含成分复杂,灌流液往往为混悬液,浓度大时易造成肠道堵塞,混悬物也易滞留在肠道中,可导致成分吸收的假阳性。有文献[81]采用超声20min,4000r·min-1离心5min,取上清液的方法制备含药灌流液,经实验证实可避免上述问题出现。以蠕动泵持续向肠段供给上清液,保证了吸收时药物溶液为持续饱和状态,模拟人体口服药物混悬液,成分一旦吸收导致药物浓度减小,即有沉淀溶解补充保证饱和的状态,更符合中药复方的吸收特性,但需检测离心后上清液中各成分的含量以供下步计算。
 
  4.4灌流通路饱和通常以聚乙烯软管作为灌流通路,某些成分可能被软管吸附造成假阳性吸收,因此在正式实验前需对软管进行饱和处理,即以蠕动泵将所需通路在配制好的灌流液中以低流速循环灌流过夜。
 
  4.5 肠壁物理吸附考察
 
  一般情况下经肠道灌流后成分减少即被认为已吸收,而实际上还可能由肠壁吸附、药物代谢等引起,故通常Papp值会比实际值大[91]。因此,需考察肠壁对研究成分的吸附情况,即剪取所考察肠段,将黏膜层翻出,洗净后置于已知浓度的灌流液中37℃孵育2h后,测定成分含量的变化[92]。对于可能由药物肠道代谢引起的减少,可通过空白灌流液经肠灌流后与药物孵育检测变化,或者直接检测代谢物进行验证。
 
  4.6大鼠禁食时间[67]建议禁食16~18h以保证试验时肠内容物少,自由饮水过夜,但需要将大鼠饲养在悬挂笼内以免大鼠因过长时间的禁食而进食排泄物。
 
  4.7 麻醉方式
 
  实验室常用的麻醉剂为乙醚、水合氯醛、乌拉坦、戊巴比妥钠等。乙醚药量不易控制[93]。水合氯醛常用剂量为350mg·kg-1,麻醉时间约为2h,动物肌肉松弛效果较差[94]。乌拉坦为长效麻醉剂,作用温和持久,常用剂量为1000mg·kg-1,麻醉时间约为3h,可深度麻醉,肌肉松弛效果好,但毒性较强[93]。有研究[95]表明水合氯醛对离体十二指肠平滑肌收缩有较强抑制作用,乌拉坦次之,戊巴比妥钠最弱,因此进行麻醉大鼠小肠运动的中枢调控机制的研究时,宜采用戊巴比妥钠麻醉。但戊巴比妥钠为管制精神类药物,不易获取,建议采用乌拉坦麻醉。此外,有条件也可选择小动物麻醉仪。
 
  4.8肠道定位SPIP模型在实验过程中需注意牵拉对肠道的正常功能的影响。常用牵拉器械为弯镊,可在两镊子头套上塑料软管,以减少器械对肠段的损伤。此外,由于生理结构特点,大鼠十二指肠前半部分周围包覆胰腺组织,且位于结肠之下,在操作时难以牵拉出测量长度,以体重(200±20)g的雄性SD大鼠为例,其中无法观察到的十二指肠长度约为6cm,因此可在距幽门1cm处插管结扎后,将空肠等肠段牵拉出体外至无法牵拉后取4cm插管结扎作为十二指肠的考察肠段。
 
  4.9肠道平衡流速对于平衡时流速大部分学者采用0.1~0.4mL·min-1的流速平衡30min后开始计时,流速越低所需平衡时间越长[67],也有学者采用1.0mL·min-1的流速平衡10min后直接换成0.2mL·min-1的流速进行灌流[96],还有的是以1.0mL·min-1的流速平衡10min后,改为0.2mL·min-1的流速继续平衡20min后,开始计时[97],既可使肠道内迅速充满含药灌流液,又能使肠段提前适应正式计时的流速。
 
  4.10肠段测量取样结束后,需测量肠段的长度与内径,但内径是无法准确测量的,因此在数据处理过程中常将肠腔内径均假定为定值,已被广泛应用[98]。十二指肠、空肠和回肠的内径十分接近,三者间的Papp值具有较强的可比性,但结肠腔的内径较大,如果把结肠的内径等同于其他肠段内径进行处理,必定会使Papp值偏大,因此对肠腔内径相差显著的肠段进行药物吸收比较时应慎重考虑[98]。此外,有文献[99]指出,对于大鼠,小肠肠腔内径为0.15~0.17cm,常用0.16cm;而大肠腔内径为0.15~0.25cm,常用0.20cm,二者相差较大。
 
  对于测量肠段长度的时间,有学者建议取样结束后立即处死大鼠取出考察肠段测量[91],但此时由于肠道尚有活性,会有一定程度的收缩,容易造成测量结果偏差,因此建议待大鼠死亡5~10min后测量。
 
  5小结
 
  SPIP在一定程度上准确模拟了口服药物的在体吸收,应用越来越广泛。但目前多集中在单个成分和主要成分配伍前后吸收差异的比较,对复方多成分配伍吸收机制的阐明仍显不足。而且研究多以正常动物为对象,鲜有涉及病理模型动物,正常动物与病理模型动物之间肠道吸收的差异需引起关注[100]。药物的肠吸收是一个复杂的过程,易受到肠道菌群和肠道代谢酶的影响,通过SPIP检测到的成分减少不一定是被吸收,也可能是在肠道内发生代谢或蓄积在肠壁中[54],应用2种以上的试验方法并结合吸收入血成分研究,结果才更科学可靠。
 
  在体肠灌流实际上反映的是各组分表观吸收,欲进一步了解其吸收机制,还需结合单个药物、成分的单向肠灌流研究及在体吸收研究。在单一成分研究的基础上,再对其多成分环境下的特征和规律进行研究,回归到以中药或复方为整体的研究中去[1]。
 
  中药活性成分在胃肠转运过程中的吸收与代谢是中药产生生物效应的重要环节,不吸收或以往研究认为的无效成分可能对有效成分的肠吸收产生影响,这些成分就不再为无效成分。以SPIP模型、外翻肠囊模型获取肠吸收谱,进行谱-效寻找药效物质基础,避免了血清谱复杂的体内分布、代谢过程带来的难题,且不易遗漏不吸收的有效组分,更加简便,更适用于复方药效物质基础的研究。
 
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