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转基因生物反应器在生物制药领域的应用

2020-04-02 16:49 出处:未知 人气: 评论(0
  摘要:随着重组抗凝血酶Atryn和重组人C1酯酶抑制剂Ruconest在美国和欧盟分别获批,转基因生物反应器在生物制药领域受到了更多的重视。转基因生物反应器主要包括转基因动物的乳汁、血液、尿液、精液及蛋清等。应用转基因生物反应器,可降低药物生产成本,提高产量,且安全性更高。本文就转基因生物反应器在生物制药领域的研究和应用现状作一综述。
 
  关键词:转基因生物反应器;生物制药;应用
 
  生物技术药物的研发标志着医药高科技发展的方向和水平,从重组人胰岛素到干扰素及单克隆抗体,这些生物制剂挽救及延长了许多患者的生命,提高了深受糖尿病、感染性疾病、癌症和血友病等疾病困扰患者的生活质量。随着生物技术水平的提高,科学家对疾病有了更深层、更多角度的认识,生物技术药物将不断走向成熟,将有更多的患者受益。2006年,全球生物技术药物销售额为790亿美元,在全部药品市场占比仅为14%;至2013年,全球生物技术药物增至1650亿美元,占比提高至22%;2013年,中国生物技术药物的市场销售额达1085亿元;预计至2020年,全球生物技术药物销售额将达2910亿美元,所占比将超过25%,尽管生物技术药物在整个医药市场增长较为平缓,但在全球销售额排名前100位药物中却增长较快,如2006年,占比仅为21%,2013年增至45%,预计2020年将超过50%,达52%[1]。
 
  1基因工程药物的分类
 
  中国生物制药的发展经历了3个阶段,即传统中草药提取活性成分并加工、化学合成更高效而廉价的新药、基于DNA重组技术开发基因工程药物[2]。根据表达载体的不同,目前基因工程药物可分为3大类:①通过细菌等原核细胞生产的药物。该表达体系操作简单,表达量高,但易形成包涵体,且缺乏翻译后修饰,导致有些蛋白缺乏天然活性;②通过真核细胞表达的药物。该表达体系可进行翻译后修饰,能够表达高活性的蛋白,但存在培养条件要求及成本较高等问题;③通过转基因动物及植物体内表达。由于外源DNA插入基因组,可随动植物细胞的分裂而稳定传代,大幅降低药物生产成本及药品价格,但由于动物来源、饲养环境等因素,该表达体系表达的蛋白在质量控制中必须重视对动物源细菌、病毒、寄生虫的检验。
 
  2转基因动物及植物
 
  将外源重组基因转染并整合至动物、植物受体细胞基因组中,从而形成在体内表达外源基因的动物、植物,称为转基因动物、植物。
 
  2.1转基因植物转基因植物的优势在于生产成本低,无哺乳动物致病菌等。但其翻译后修饰与哺乳动物比较,在N-末端残基和O糖的修饰上均有不同。Medicago公司正将人类DNA移至苜蓿属植物中,并从中提取出了胰岛素、麦谷蛋白、IL-2及其他抗体;FUJIWARA等[3]在水稻种子中表达和纯化了鼠IL-4和鼠IL-6;ZVIRIN等[4]在转基因烟草中成功表达出有活性的阿达木单抗;中国武汉禾元生物科技股份有限公司开发的基于水稻胚乳细胞生物反应器的重组人血清白蛋白注射液已获批临床试验,该公司另一项基于水稻胚乳细胞生物反应器的重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液正处于临床申报中[1]。
 
  2.2转基因动物 转基因动物平台具有生产成本低,产量大的优点[5-7]。由于人类和哺乳动物间的亲缘关系较近,转基因哺乳动物生物反应器所生产的重组蛋白在结构上与人体内的天然蛋白更为接近,也更加安全有效[8]。在转基因动物乳汁中表达重组蛋白被认为是生物制药中最可行方法之一[9-13]。乳汁易取,获得量较大,且每升乳汁中表达的重组蛋白可达克级[7-8,14]。另外,乳汁表达重组蛋白的纯化技术也得到极大发展,促进了各种转基因乳腺反应器用于生物制药项目的发展[7]。将CHO细胞用于一个10万升的生物反应器通常需要花费约4亿美元,整个过程需要3~5年[15],而转基因动物平台及纯化装置花费低于8000万美元[16],且操作时间更短。
 
  在乳汁表达重组蛋白的动物模型中,山羊占重要地位[17-19]。该物种具有维护成本低、世代间隔短、早熟、繁殖能力强及奶产量较高的优点,使其表达重组蛋白可在短时间内获得较高的产量。从羊奶中生产的重组人抗凝血酶ⅢATryn(美国rEVO生物技术公司)是第一个从转基因动物生产的人用生物制品。ATryn于2006年获得欧洲药品管理局(EMA)批准在欧盟国家上市,2009年获得美国FDA批准上市。随后,另一个从兔奶中表达的重组人C1酯酶抑制剂Ru-conest(Pharming公司)于2012年获得EMA批准上市,2014年获得FDA批准上市。
 
  2.3转基因动物表达技术的发展虽然转基因动物被证实是可以用于生物制药的良好平台,但有些种系的转基因动物在传代过程中会出现表达下降的现象[15,17,20-24]。用于生物制药的大型转基因动物的低效表达催生了经典方法和配套技术的发展。
 
  原核显微注射作为最传统的基因融合方法,存在效率低的问题,而通过体细胞核移植(somaticcellnucleartransfer,SCNT)形成克隆是一个较为可靠的方法[25],该方法可在培养中转入DNA,并通过后续筛选过程,得到确定的性别、拷贝数、基因插入位置[26-27]和染色体位置[28]的克隆。由于SCNT更易在转基因胚胎形成,与原核显微注射和慢病毒载体等技术比较,SCNT用于转基因动物的研究更多,特别是在山羊体内[17,28-32]。
 
  随着TALENs[33]和CRISPR/Cas9[34-36]等核酸定点改造技术的发展,细胞工程和转基因动物获得新发展。这些核酸编码技术是用于基因工程的有效手段,尤其是这些技术大幅提高了外源基因或DNA序列插入特定位点的精确性[37-38]。
 
  2.4转基因动物的应用目前,基因工程动物广泛应用于提高产品品质[如AquaAdvantage大马哈鱼(美国AquaBounty公司)]、降低或限制畜牧生产对环境带来的伤害[如EnviropigTM(圭尔夫大学)]、增加动物制品的价值[营养添加奶,如人溶菌酶羊奶(加州大学)及人乳铁蛋白牛奶(荷兰Pharming公司)]、提高疾病抵抗力[不感染禽流感的鸡(英国Roslin研究所)]、生产观赏性生物[可发荧光的鱼(YorktownTechnologies)]、支持工业生产[蜘蛛丝转基因羊(犹他州立大学)]及在血液、尿液、精液、唾液腺[39]、蛋清或乳汁生产重组蛋白等。
 
  首先应用于生产重组蛋白的家畜是转基因猪、兔和绵羊[40]。该项目符合大多数生物技术企业在药物生产创新和策略转变方面的需求。随后,由于具有较好的生产效率,将生物医疗类蛋白的生产与动物特定的器官及体液进行结合[41],近30年中,通过转基因动物模型已生产了许多有价值的治疗类蛋白产品[42-45]。
 
  2.5转基因动物生物反应器选择合适的方法表达某种蛋白,取决于该蛋白的特性和用途。转基因动物的乳腺是用于重组蛋白生产的最主要的生物反应器,其次为血液、尿液、精清、蛋等[46-49]。上述生物反应器均可获得较高的重组蛋白表达量[50],如在转基因牛的奶汁中表达重组人血白蛋白,表达量可达1~5g/L[51];在转基因母鸡的蛋清中表达重组人IFN-β可达3.5mg/mL[49]。另外,用转基因动物生物反应器生产的重组蛋白易于收集,且与细胞培养比较,用于生产的成本更低[52]。
 
  2.5.1血液血液作为转基因动物生物反应器,最早是于1991年在转基因兔的血清中表达人α1-抗胰蛋白酶[46]。随后,在转基因猪的血清中表达重组人血红蛋白,不仅表达量高且均具有正确的生理功能[44-45],但由于从非常相似的猪蛋白中纯化人蛋白存在较大困难[53],该模型已停止生产。采用该反应系统,可在基因编辑过的转基因牛中表达全人源单抗,即携带可特定表达人免疫球蛋白(Ig)重链(hIGH)、κ链(hIGK)和λ链(hIGL)的人工染色体。采用该系统,在敲除牛的免疫球蛋白基因(bIGHM和bIGHML1)后,hIgGs可得到有效表达[54]。牛的免疫球蛋白基因被失活,而人免疫球蛋白基因被转移至该处。未来,将有更多从血液中提纯的人多克隆抗体供患者使用。另外,有一些研究机构(如美国CrystalBioscience)正在尝试采用鸡模型生产人源抗体[55]。以血液作为表达系统,不能储存大量的重组蛋白[6],蛋白收集也具有损害性[56],且蛋白生物学活性有可能影响动物的健康[5]。2.5.2尿液为克服血液作为转基因动物生物反应器的缺点,一种替代方法是采用工程化膀胱上皮细胞生产特定的蛋白并分泌进入尿液[47]。该方法与乳腺反应器比较,动物产尿比泌乳早得多,且重组蛋白能以更合适的方式成熟[56]。与血液反应器比较,外源蛋白对动物体健康产生的影响更小[57],但从膀胱上皮细胞分泌的蛋白通常产量较低[19]。
 
  2.5.3精液精液在某些雄性动物中(如猪)是一种较大量的体液,且易于收集[56],对动物造成危害较小。因此,被认为是转基因动物表达重组蛋白的有效途径[48]。附属性腺如前列腺和尿道球腺,负责精液中大部分蛋白的生产和分泌。1999年,Dyck等开发了一种转基因小鼠,采用蛋白酶抑制剂P12启动子调控人生长激素(humangrowthhormone,hGH)在转基因小鼠精液中的表达,表达量可达0.5g/L。由于其严格的蛋白外分泌表达,对动物健康无负面影响,且在蛋白加工、稳定性和纯化上的巨大潜能[53],精液非常适合于有生物学活性蛋白的生产。另外,复杂蛋白如何在精液中成熟和分泌[56]、对生殖能力的影响及对转基因动物品系维护的影响均尚未明确。
 
  2.5.4蛋清采用转基因鸡的蛋清作为生物反应器,符合生物技术公司对重组蛋白高产量的要求[58]。1只母鸡1年最多可产蛋330只,而每个鸡蛋的蛋清大约含有4g蛋白。采用转基因鸡蛋生产蛋白的最大优势在于代次时间短,且通过人工授精可得到较高的繁殖率[59]。OISHI等[49]应用CRISPR-Cas9方法构建转基因鸡的蛋清中,IFNβ表达量可达约3.5mg/mL。近期也有研究得到了在蛋清中表达人表皮生长因子(humanepidermalgrowthfactor,hEGF)的转基因鸡,目前已有多家公司致力于该类产品的开发[53]。溶酶体酸脂肪酶不足(lysosomalacidlipasedeficiency,LAL-D)是一种具有高发病率和死亡率的罕见基因疾病,Alexion公司开发了一种用于治疗LAL-D的重组人溶酶体酸性脂肪酶(lysosomalacidlipase,LAL)Ka-numa,该药已于2015年获得FDA批准上市。SBC-103是一种重组人α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(recombinanthumanalpha-N-acetylglucosami-nidase,rhNAG-LU),用于治疗罕见的婴儿代谢疾病黏多糖病ⅢB(Muco-polysac-charidosistypeⅢB,MPSⅢB),已处于临床试验阶段,并已于2015年1月进入FDA快速审批通道。
 
  2.5.5乳汁迄今为止,乳汁是最成熟的用于生产重组蛋白的转基因系统[60-61],可获得较高产量的重组蛋白[62]。许多人源重组蛋白需经翻译修饰才能具有生物学活性和稳定性,乳腺组织的糖基化模式与人天然蛋白相似[8,63]。除了牛、绵羊、山羊等传统乳制品物种外,兔和猪的乳汁也可用于重组蛋白的表达。这些物种作为乳腺反应器生产重组蛋白各有优缺点[6]。第一个商业化由转基因动物表达的重组蛋白ATryn获批用于治疗遗传性抗凝血酶缺乏症[8,64],这不仅是对该制品,更是对转基因动物生产平台的肯定[51]。另一个在转基因兔的乳腺中生产的重组蛋白Rucones(tC1酯酶抑制剂),获批用于治疗成人和青少年急性遗传性血管水肿,进一步证实了该平台的有效性。
 
  3小结及展望
 
  开发新的生物制品是一项艰巨任务,自DNA重组技术出现以来已获得巨大发展。在快速扩大的市场中,作为行业高速增长的代表,生物制药领域需进一步提高生产率并减低成本。在转基因动物的乳汁中生产治疗类蛋白为不断扩大的市场引进了更为经济高效的生产方式。目前,已有2个乳汁中生产和1个在蛋清中表达的重组蛋白获批上市,由转基因动物生产治疗类蛋白用于人类疾病的治疗已成为现实。转基因动物表达系统可用于生产具有生物学活性的产品,如疫苗、抗体和其他生物制品以满足市场的需求[65-67]。科学机遇和不断扩大的市场一直在推动创新,以确保药物研发和应用的可持续性。随着对高质量生物制品需求的不断提高,创新研发的新药物将更好地消除疾病,促进健康,不断改善人们的生活,提高幸福度。
 
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