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新型抗菌肽设计及医学应用探索

2020-04-02 16:35 出处:未知 人气: 评论(0
  摘要:抗菌肽是一类具有广谱抗菌性的短肽,在医学应用中有巨大潜力。本文综述了抗菌肽的特性、作用机制及体外生产,并依据抗菌肽的基本特性设计新型抗菌多肽片段,并设计相应的验证实验。通过人为设计毒性较低、稳定性与抗菌活性较高的抗菌肽。然后,寻找合适的体外表达方法,最终实现抗菌肽的量产。本研究为新型抗菌肽设计研究提供了生物学理论指导,并为其在医学上的应用打下基础。
 
  关键词:抗菌肽;体外表达;人工设计
 
  自19世纪70年代青霉素被发现以来,抗生素便成为了人类的救星,拯救了数不胜数的生命。近年来,人类对抗生素的滥用、误用,导致细菌产生了抗药性,越来越难被杀死,更有甚者成为了无药可医的“超级细菌”。在寻找抗生素替代品的过程中,不易使靶菌株产生抗性突变的抗菌肽进入了人们的视野。本文综述了抗菌肽的特性、作用机制及体外生产,并依据抗菌肽的基本特征设计新型抗菌多肽片段,并设计相应验证实验。
 
  一、抗菌肽
 
  抗菌肽(AMPS)是一类具有抗菌作用的短肽,在细菌、昆虫、两栖动物、植物、哺乳动物等生物中均有存在。世界上第一个被发现的抗菌肽—天蚕素,是1980年由瑞典科学家G.Boman等人在研究惜古比天蚕的免疫机制时,发现滞育蛹经外界刺激诱导后,其血淋巴中产生的具有抑菌作用的多肽物质[1]。随后,科学家们发现了大量的抗菌肽,其主要特性主要有:1.广谱抗菌性,对细菌、真菌、病毒、寄生虫等病原微生物,乃至肿瘤细胞都有抵抗作用;2.阳离子性,抗菌肽一般带有2~9个正电荷,带正电荷的多少取决于肽链中碱性氨基酸的含量[2];3.分子量小,约为4ku,一般由20~60个氨基酸残基组成;4.热稳定性好,在100℃加热条件下,可以保持活性15min[3];5.两亲性,抗菌肽既可以溶于水,又可以溶于有机溶剂[4];6.C端含有疏水氨基酸残基,包括酪氨酸、色氨酸等。
 
  抗菌肽的抗菌机制,研究者们主要发现有两种:一是破坏膜结构,使细胞内容物泄露,从而杀死细胞。抗菌肽带有正电荷。因此,可以吸附到带负电的细胞膜上,其疏水端插入细胞膜的磷脂双分子层中,改变膜结构,打破渗透压平衡,导致细胞死亡[5];二是进入细胞质干扰代谢过程。如,阻断DNA复制和RNA合成,影响蛋白质的合成,抑制细胞壁的合成等方式使细胞死亡[6]。
 
  二、抗菌肽的生产
 
  抗菌肽在医学中具有广阔的应用前景。但大规模应用的基础是能大批量生产。因此,我们需要找到适合大批量生产抗菌肽的途径。目前,我国生产抗菌肽的方法主要有三种:从天然生物资源中分离纯化、人工化学合成及利用基因工程的手段进行体外表达。
 
  分离纯化的过程是利用高速离心、分子筛、固相萃取、离子交换色谱、阳离子交换层析、反相高效液相色潽等方法,多步骤进行分离纯化[7]。化学合成指人工将氨基酸连接为抗菌肽的方法。因抗菌肽的天然资源有限、提取技术尚不成熟,而且成本较高。化学合成方式具有成本高、效率低、产物活性不稳定等问题。因此,利用基因工程的手段进行体外表达,有很大的发展潜力。
 
  抗菌肽的体外表达系统分为真核表达系统和原核表达系统。因抗菌肽分子量小,而且基本不需要修饰加工,把载体蛋白与抗菌肽融合表达,就能保护宿主细胞及抗菌肽等。因此,利用原核表达系统,表达抗菌肽是目前的最佳选择。在大肠杆菌中表达,需将抗菌肽与载体蛋白融合表达,避免对宿主的杀伤,常用的载体蛋白有协助抗菌肽可溶性表达的载体蛋白和协助抗菌肽包涵体表达的载体蛋白两类。协助抗菌肽可溶性表达的载体蛋白中,常见的有硫氧还蛋白、谷胱甘肽转移酶等。硫氧还蛋白是使用频率最高的载体蛋白,大约占融合表达的25%以上。它有分子量小(11.8ku)、可溶性好、可提高融合蛋白的产量等优势[8]。硫氧还蛋白需要与His标签融合,以便分离载体蛋白与目的产物。谷胱甘肽转移酶可提高抗菌肽的稳定性和可溶性,也可以直接作为载体蛋白分离纯化的标签。但其分子量比较大(27ku),会使抗菌肽在载体蛋白中占比较小,降低抗菌肽的表达效率[9]。协助抗菌肽包涵体表达的载体蛋白,包括:类固醇异构酶、PurF片段、PaP3.30及TAF12组蛋白折叠结构域等[10]。
 
  三、新型抗菌肽设计
 
  自然界有大量的抗菌肽,并展现出相似的功能特性。因此,认识并寻找多肽序列与其功能间的规律具有重要意义,可以帮助我们设计出高稳定性、高抗菌活性、低毒性的抗菌肽。天蚕素类抗菌肽结构简单、抗菌谱广,是当前抗菌肽设计的热点,本节借鉴天蚕素类抗菌肽的基本结构特征从头设计抗菌肽。
 
  (一)天然抗菌肽的修饰方法
 
  我们对天然抗菌肽进行修饰,可以提高其稳定性和抗菌活性、减弱毒性。修饰方法包括:1.将N端乙酰化以提高抗菌肽稳定性;2.通过C端酰胺化[11]、增大C端的疏水性[12]、使α螺旋中包含天冬氨酸[13]以提高其抗菌活性;3.通过残基替换以减弱抗菌肽的毒性。如,用天冬氨酸替换亮氨酸等。
 
  (二)天蚕素类抗菌肽的基本结构
 
  天蚕素类抗菌肽两端各有一段两亲性的α螺旋。同时,N端为碱性氨基酸残基,C端为疏水性氨基酸残基;中部为一段亲水的非螺旋结构,并包含甘氨酸和脯氨酸。其中,两亲性的α螺旋对抗菌肽的抗菌活性起主要作用,而中部结构可增加其弹性[12]。
 
  (三)新型抗菌肽设计
 
  基于天蚕素类抗菌肽的基本结构与上述修饰方法,作者设计了如下四条抗菌肽[14]:
 
  1.KADCADCGKKKKKKKADCADCPPPPN
 
  2.KADCADCGKKKKKKKKKKKADCADCPPPPN
 
  3.KADCADCGKKKKKADCADCPPPPN
 
  4.KADCADCGKKKKKKKADCADCPPPPPPPN
 
  第一条序列结构中N端为带正电的赖氨酸,并乙酰化修饰,C端有3个增加疏水性的脯氨酸,体外表达无法将抗菌肽C端酰胺化,故添加了天冬酰胺[15]。N端α螺旋结构为疏—亲—不亲疏—疏—亲—不亲疏—终止,亲水肽段和疏水肽段集中分布在α螺旋两侧,保证α螺旋的两亲性及抗菌活性。C端螺旋同N端。但将终止氨基酸换为疏水性的脯氨酸,中部为7个赖氨酸增加正电荷数。此抗菌肽分子量约为3ku,带4个净正电荷,共7种26个氨基酸残基。其中,有12个亲水性氨基酸残基,有8个疏水性氨基酸残基,亲水、疏水性氨基酸数量相近。增加净正电荷数及疏水性可以提高抗菌肽的抗菌活性。但过高的净正电荷会对抗菌活性造成不利影响,提高疏水性也会提高溶血性[12]。因此,为了探究净正电荷数及疏水程度对其抗菌活性和溶血性的影响,作者在第1条抗菌肽基础上做了如下设计。其中,第2、3条与原抗菌肽带净正电荷数不同,分别带有8个、2个净正电荷;第4条多肽链C端多了3个脯氨酸,疏水性大于原抗菌肽。
 
  (四)抗菌活性与溶血性验证实验设计
 
  1.抗菌活性测定。实验菌株选用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌ATCC25922和啤酒酵母菌,分别代表革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌,验证设计多肽的抗菌活性。
 
  将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌ATCC25922和啤酒酵母菌分别培养至对数期后,向96孔板中加入等量菌悬液与等量、等浓度,不同种类的设计肽溶液,对照组加入无水乙醇。培养24小时后,每孔分别加入等量等浓度的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC),避光培养4小时后,观察各组的颜色变化,颜色越浅,表示抗菌活性越强。
 
  2.溶血性的测定。将红血细胞用生理盐水配成2%的混悬液,取等量红细胞混悬液若干份,分别向其中加入等量、等浓度,不同种类的设计肽溶液。轻混后,置37℃的恒温箱中温育。3小时后离心,取上清液,测545nm吸光值,计算溶血率和LD50值(溶血率达50%)。溶血率(%)=(试验管吸光度-阴性对照管吸光度)/(阳性对照管吸光度-阴性对照管吸光度)×100%;以0.9%生理盐水作为阴性对照,蒸馏水作为阳性对照。
 
  四、总结与展望
 
  本文设计了新的抗菌肽片段,并设计实验验证其抗菌活性和溶血性。然后,将具有最佳抗菌活性的净正电荷数与最低溶血性的脯氨酸数组合,便可得到低副作用、高稳定性和高抗菌活性的新抗菌肽。再利用基因工程手段进行体外大量表达,帮助我们理解抗菌肽序列与其功能间的规律,并为其在医学上的应用提供参考和帮助。
 
  参考文献:
 
  [1]BOMANHG,NILSSONI,RASMRSNNB.InducibleantibacterialdefensesysteminDrosophial[J].Nature,1972,237:232-235.
 
  [2]HANCOCKRE,LEHRERR.Cationicpeptides:anewsourceofantibiotics[J].TrendsBiotechnol,1998,16:82-88.
 
  [3]李冠楠,夏雪娟,隆耀航,等.抗菌肽的研究进展及其应用[J].动物营养学报2014,26(1):17-25.
 
  [4]THEIST,STAHLU.Antifungalproteins:targets,mechanismsandprospectiveapplications[J].CellularandMolecularLifeScience:CMLS,2004,61(4):437-455
 
 [5]PANDEYBK,SRIVASTAVAS,SINGHM,etal.Inducingtoxicitybyintroducingaleucine-zipper-likemotifinfrogantimicrobialpeptide,magainin2[J]BiochemicalJournal,2011,436(3):609-620.
 
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  [7]郭鑫杰,袁凯松,简敬一,等.抗菌肽分离纯化分析研究进展[J].国外医药抗生素分册,2017,38(11).
 
               [8]LAVALLIEER,DIBLASIOEA,KOVACICS,etal.AthioredoxingenefusionexpressionsystemthatcircumventsinclusionbodyformationintheE.colicytoplasm.NatBiotechnol,1993,11(2):187-193.
 
       [9]LIYF.CARRIERPROTEINSforfusionexpressionofantimicrobialpeptidesinEscherichiacoli.BiotechnolApplBiochem,2009,54(1):1-9. 
         [10]VIDOVICV,PRONGIDIFIXL,BechingerB,etal.ProductionandisotopelabelingofantimicrobialpeptidesinEscherichiacolibymeansofanovelfusionpartnerthatenableshigh-yieldinsolubleexpressionandfastpurification.JPeptideSci,2009,15(4):278-284.
 
  [11]TOSSIA,SANDRIL.MOLECULARdiversityingene-encoded,cationicantimicrobialpolypeptides[J].CurrPharmDes,2002,8(9):743-761.
 
  [12]韩晋辉,翟培,施用晖.人工设计天蚕素抗菌肽AMP-D及其活性测定[J].中国畜牧兽医,2012,39(7).
 
  [13]陶立国.人工设计多肽的结构及其抗菌机理研究[D].江苏大学,2016.
 
  [14]韩晋辉.设计抗菌肽在大肠杆菌中的表达及其活性研究[D].江南大学,2006.
 
  [15]李启辉.以天蚕素为基础的抗菌肽设计及其基因表达[D].江南大学,2004.
 
  
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